Nichtklassische Mechanismen zur irreversiblen Unterdrückung von β

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 783 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Kristallisation von Hämatin ist ein wesentliches Element der Häm-Entgiftung von Malariaparasiten und ihre Hemmung durch Malariamedikamente ist ein gängiger Behandlungsweg. Wir demonstrieren unter biomimetischen Bedingungen in vitro eine irreversible Hemmung des Hämatinkristallwachstums aufgrund unterschiedlicher kooperativer Mechanismen, die bei hohen Kristallisationsantriebskräften aktiviert werden. Die Entwicklung der Kristallform nach zeitlich begrenzter Einwirkung sowohl von Artemisinin-Metaboliten als auch von Antimalariamitteln der Chinolin-Klasse weist darauf hin, dass das Kristallwachstum unterdrückt bleibt, nachdem die Artemisinin-Metaboliten und die Arzneimittel aus der Lösung entfernt wurden. Die Behandlung von Malariaparasiten mit denselben Wirkstoffen zeigt, dass drei- und sechsstündige Inhibitorimpulse das Parasitenwachstum mit einer Wirksamkeit hemmen, die mit der einer Inhibitorexposition während der gesamten Lebensdauer des Parasiten vergleichbar ist. Zeitaufgelöste In-situ-Rasterkraftmikroskopie (AFM), ergänzt durch Lichtstreuung, deckt zwei Mechanismen der Inhibitorwirkung auf molekularer Ebene auf, die die Wiederherstellung des β-Hämatin-Wachstums verhindern. Hämatinaddukte von Artemisininen regen die reichliche Keimbildung nicht dehnbarer Nanokristalle an, die sich in größere wachsende Kristalle integrieren, während Pyronaridin, ein Medikament der Chinolinklasse, Stufenbündel fördert, die sich zu zahlreichen Versetzungen entwickeln. Es ist bekannt, dass sowohl eingebaute Kristalle als auch Versetzungen eine Gitterspannung induzieren, die bestehen bleibt und das Kristallwachstum dauerhaft behindert. Keimbildung, Stufenbündelung und andere kooperative Verhaltensweisen können verstärkt oder eingeschränkt werden, um Kristallgrößen, Größenverteilungen, Aspektverhältnisse und andere Eigenschaften zu steuern, die für zahlreiche Bereiche, die auf kristallinen Materialien basieren, wesentlich sind.

Hämatin ist das Produkt der Oxidation von Häm, das in der Verdauungsvakuole von Malariaparasiten freigesetzt wird, wenn diese Hämoglobin verstoffwechseln1. Um sich gegen die Toxizität von Hämatin zu wehren, binden die Parasiten es in das harmlose kristalline Hämozoin2. Mehrere Antimalariamittel, wie Antimalariamittel der Chinolin-Klasse3,4 und die Hämatinaddukte von Arzneimitteln der Artemisinin-Klasse, die vom Metabolismus des Parasiten produziert werden5,6, töten die Parasiten ab, indem sie die Hämatinkristallisation hemmen, was die Konzentration des toxischen freien Hämatins erhöht. Um zu modellieren, wie Medikamente mit begrenzten Verweilzeiten P. falciparum-Parasiten beseitigen, untersuchen wir, ob Malariamedikamente Wege einschlagen können, die zu einer Hemmung des Hämatinkristallwachstums führen, die auch nach der Entfernung eines Inhibitors aus dem System anhält. Wir testen, ob eine irreversible Hemmung der Hämatinkristallisation mit der wirksamen Unterdrückung von Malariaparasiten durch zeitlich begrenzte Impulse von fünf Antimalariaverbindungen korreliert.

Wir untersuchen die Reversibilität der Hemmung des Wachstums von β-Hämatinkristallen (Abb. 1a), einem synthetischen Analogon zu Hämozoin1. Um die physiologische Relevanz der erhaltenen Ergebnisse zu fördern, verwenden wir als Lösungsmittel mit Zitronensäurepuffer gesättigtes Octanol, ein Analogon zur Lipid-Subphase in der Verdauungsvakuole des Parasiten7,8,9,10. Wir untersuchten die Aktivität von drei Antimalariamitteln der Chinolin-Klasse, Pyronaridin (PY), Chloroquin (CQ) und Mefloquin (MQ), sowie die Hämatin-Addukte von zwei Arzneimitteln der Artemisinin-Klasse11,12, Artemisinin (H-ART) und Artesunat (H -ARS)5. Die Chinoline hemmen die Hämatinkristallisation sowohl in vivo als auch in vitro13,14,15. Die Hämatinaddukte von Arzneimitteln der Artemisinin-Klasse entstehen als Produkt des Hämoglobinstoffwechsels in der Verdauungsvakuole des Parasiten6,16,17 und unterdrücken auch die Hämatinkristallisation5.

a Ein Rasterelektronenmikroskop (REM)-Bild und eine schematische Darstellung, die den β-Hämatin-Kristallhabitus und die Definitionen der Kristalllänge \(l\) und der Breite \(w\) veranschaulichen. In der Hämatin-Kristallstruktur stellen graue Kugeln C, Blau, N, Silber, H und Rot O dar. b SEM-Bilder von β-Hämatin-Kristallen, die zu Zeiten und Zusammensetzungen gewachsen sind, die in (d) mit (i)–(iii) angegeben sind. in Gegenwart von 10 μM PY. c Schematische Darstellung der Erhaltung der Kristallform während des Wachstums in reinen Lösungen und der Inhibitor-induzierten Unterdrückung von \(l\) oder \(w\) durch Wechselwirkung eines Inhibitors mit axialen bzw. lateralen Kristallflächen. Konzentrische Konturen bezeichnen die Kristallform bei zunehmenden Wachstumszeiten. d Schematische Darstellung der Variation der Inhibitorkonzentration, die zum Testen der Reversibilität der Hemmung von \(l\) und \(w\) verwendet wird. Die durchgezogene blaue Linie zeigt Kristalle an, die 3 Tage lang einer Inhibitorkonzentration von X μM (wobei X = 10 für H-ART, H-ARS und PY; 2 für CQ und 5 für MQ) ausgesetzt waren Metaboliten- oder arzneimittelfreie Lösung für 10 Tage. Die orange gestrichelte Linie stellt Kristalle dar, die 13 Tage lang bei einer konstanten Inhibitorkonzentration von X μM gehalten wurden. Die gepunktete violette Linie zeigt Kristalle, die 3 Tage lang einer Inhibitorkonzentration von X μM ausgesetzt waren; Die kurz gestrichelte graue Linie zeigt Kontrollen an, die 13 Tage lang in einer metabolit- oder arzneimittelfreien Lösung gewachsen sind. Die Zahlen (i)–(iii) geben Zusammensetzungen und Erntezeiten von Kristallen an, die in Gegenwart von PY gezüchtet und in Tafel (b) abgebildet sind. e Längen und Breiten von Kristallen, die in 0,5 mM Hämatinlösungen und in Gegenwart von 10 μM H-ART, H-ARS und PY, 2 μM CQ und 5 μM MQ in der Ausgangslösung gezüchtet wurden. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen von Durchschnittswerten über ca. 30 Kristalle für jedes Zusammensetzungsregime und jede Wachstumszeit. Vertikale grüne und rote Klammern definieren die Länge oder Breite, die während des Wachstums zwischen Tag 3 und 13 entstanden ist. Horizontale grüne und rote Klammern verknüpfen Längen- und Breiteninkremente, die jeweils im Reversibilitätskriterium 1 für H-ARS und im Kriterium 2 für verglichen werden PY.

Das von uns dargelegte mechanistische Detail beleuchtet zahlreiche Beobachtungen irreversibler Kristallisationshemmung in der Natur, wo sich komplizierte Kristallarchitekturen entwickeln, die von Minderheitslösungskomponenten geleitet werden18,19. Darüber hinaus werden Industriekristalle durch spezifische Modifikatoren zu bevorzugten Morphologien geführt20,21,22,23. Die Aktivitäten der Modifikatoren werden üblicherweise auf ihre Adsorption an bestimmten Stellen der Kristalloberfläche zurückgeführt23,24,25,26 und die Reversibilität der Adsorption sagt unweigerlich voraus, dass sich das Wachstum nach Entfernung des Inhibitors vollständig erholt26,27. Mehrere Fälle dauerhaft vergifteter Kristalle28 und terminaler Kristallgrößen29,30 widersprechen dieser Vorhersage, liegen außerhalb des Bereichs der klassischen Hemmungsmechanismen und blieben bisher schwer fassbar.

β-Hämatinkristalle weisen typischerweise {100}-, {010}- und {011}-Flächen auf (Abb. 1a). Die {100}-Flächen sind die größten31 und liegen üblicherweise parallel zu einem Substrat7. Bei dieser Ausrichtung zeigt die Entwicklung der Kristalllänge, die durch Rasterelektronenmikroskopie (REM, Abb. 1b) überwacht wird, das Wachstum der {011}-Flächen, während die Kristallbreite angibt, wie schnell die {010}-Flächen wachsen (Abb. 1a, c). Bemerkenswert ist, dass die unterschiedlichen Strukturen der anisotropen Kristallflächen unterschiedliche Arten der Inhibitorbindung (an den Knicken oder auf den Terrassen) sowie Mechanismen und Grade der Hemmung auf jedem Flächentyp auswählen. Daher erwarten wir nicht, dass ein Metabolit oder ein Medikament alle Gesichter gleichmäßig hemmt, weder reversibel noch irreversibel. Um zu beurteilen, ob die Hemmung der {011}- und {010}-Flächen während der Massenkristallisation reversibel ist, setzten wir β-Hämatinkristalle drei Tage lang einem Inhibitor aus und übertrugen sie anschließend für weitere zehn Tage in arzneimittelfreie Hämatinlösungen (fest). blaue Linie in Abb. 1d). Die Hämatinkonzentration der frisch zubereiteten Lösungen betrug 0,5 mM und lag damit im Bereich von 0,2–0,6 mM, der bei unbehandelten Parasiten gefunden wird6. Wir verglichen die Längen- und Breitenzuwächse dieser Kristalle während der zusätzlichen 10 Tage metabolit- oder arzneimittelfreien Wachstums mit den äquivalenten Zuwächsen von Kristallen, die während beider Wachstumsperioden einer der beiden reinen Lösungen ausgesetzt waren (kurz gestrichelte graue Linie in Abb. 1d) oder die gleichen Metaboliten- oder Arzneimittelkonzentrationen (langgestrichelte orangefarbene Linie in Abb. 1d). Die Kristalle beider Referenzgruppen wurden nach den ersten drei Wachstumstagen in frische Lösungen überführt. Eine irreversible Hemmung würde sich in deutlich kürzeren Längen- und Breitenzuwächsen über einen Zeitraum von 10 Tagen des metaboliten- oder arzneimittelfreien Wachstums von Kristallen manifestieren, die in den ersten drei Tagen einem Inhibitor ausgesetzt waren, im Vergleich zu Kristallen, die nie einem Inhibitor ausgesetzt waren (Kriterium 1). und vergleichbar mit denen von Kristallen, die die gesamten 13 Tage in Gegenwart eines Inhibitors wuchsen (Kriterium 2). Beide Kriterien basieren auf Längen- und Breitenzuwächsen während des Wachstums in frisch hinzugefügten Lösungen, wodurch Verzerrungen aufgrund einer möglichen medikamentenbedingten verzögerten oder verstärkten Keimbildung und unterschiedlicher Kristallgrößen, die zu ungleichen Übersättigungsentwicklungen in den Test- und Referenzläufen führen können, minimiert werden.

Die anhand von REM-Aufnahmen gemessenen Längen und Breiten von β-Hämatinkristallen (Abb. 1e und ergänzende Abb. 1) zeigen, dass H-ART offenbar weder {010}- noch {011}-Flächen beeinflusst. H-ARS und die Medikamente der Chinolinklasse unterdrückten sowohl die Länge als auch die Breite der Kristalle, stoppten das Wachstum jedoch nicht vollständig, was im Einklang mit ihren bekannten Hemmaktivitäten steht15,26. H-ARS hemmt das Wachstum sowohl der {011}- als auch der {010}-Flächen irreversibel. Die Längenzuwächse der letzten 10 Tage von Kristallen, die aus reinen Lösungen nach Einwirkung von H-ARS gezüchtet wurden, ca. 4 ± 1 µm im Mittel kürzer als die ca. 8 ± 2 μm kontrollieren das Wachstum ausschließlich in reinen Lösungen (Kriterium 1, Abb. 1e) und sind vergleichbar mit den Längenzuwächsen der Kristalle, die in H-ARS-reicher Lösung über den gesamten Zeitraum von 13 Tagen wuchsen (Kriterium 2, Abb. 2e). ). Ebenso sind die während des 10-tägigen Wachstums in einer reinen Lösung entstandenen Breiten nach dreitägigem Wachstum in Gegenwart von H-ARS kürzer als die äquivalenten Breiteninkremente von Kristallen, die sowohl ausschließlich in einer reinen Lösung (Kriterium 1) als auch in Gegenwart von H-ARS gewachsen sind H-ARS für 13 Tage (Kriterium 2). Die aus der Varianzanalyse (ANOVA) der Verteilungen der Kristalllängen und -breiten (Ergänzungstabelle 1) resultierenden Parameter stützen die Schlussfolgerungen einer reversiblen Hemmung der {011}- und {010}-Flächen durch H-ART und einer irreversiblen Hemmung durch H- ARS der Gesichter {011} und {010}. Analog weisen beide Kriterien auf eine irreversible Hemmung der Kristalllänge und -breite durch PY und der Kristallbreite durch CQ hin (Abb. 1e und Ergänzungstabelle 1). Eine irreversible Hemmung der Kristalllänge durch CQ und MQ und der Kristallbreite durch MQ wird nur durch Kriterium 1 (Abb. 1e und Ergänzungstabelle 1) impliziert, was auf einen geringeren Grad an Irreversibilität der Hemmung der jeweiligen Kristallflächen durch diese beiden Arzneimittel schließen lässt.

a Die Struktur von H-ART. b, Schematische Darstellung der Schritthemmung durch Knickblocker, die sich mit den Knicken verbinden und den Zugang gelöster Moleküle behindern. c–e AFM-Bilder von (100)-β-Hämatin-Kristalloberflächen bei einer Hämatinkonzentration \({C}_{H}\) = 0,50 mM. Goldene Pfeilspitzen weisen auf Nanokristalle auf β-Hämatin-Oberflächen hin. c Standbild mit hinzugefügtem H-ART bei 10 μM. d, e Die Entwicklung von Nanokristallen in Abwesenheit von H-ART in (d) und in seiner Gegenwart in (e). f–h Lichtstreuungscharakterisierung der Aggregationsentwicklung in Hämatinlösungen. f, g Die Entwicklungen der Autokorrelationsfunktionen \(G(\tau )\) des Streulichts über 40 min in Lösungen mit \({C}_{H}\) = 0,5 mM, in (f) und mit 10 μM H-ART hinzugefügt, in (g). Abweichungen vom Nullpunkt zeigen die Bildung von Aggregaten. h Die Entwicklungen der Amplituden der Aggregatschultern von \(G(\tau)\) in (f) und (g), gemittelt über 10 Messungen; Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen an und sind kleiner als die Symbolgrößen. i Die Korrelationen der Schrittgeschwindigkeit \(v\), der Keimbildungsrate der neuen Schicht \({J}_{{{{{\rm{2D}}}}}}\) und der Kristallwachstumsrate \(V\ ) mit \({C}_{H}\). Golddiamanten, metabolitfreie Lösungen; orangefarbene Kugeln, in Gegenwart von 10 μM H-ART. Fehlerbalken bezeichnen die Standardabweichungen von den Durchschnittswerten von ca. 30 Messungen. j Sequentielle AFM-Bilder von Stufenmustern auf der (100)-β-Hämatin-Kristalloberfläche bei den auf der Tafel angegebenen Hämatin- und H-ART-Konzentrationen. Die goldene Pfeilspitze weist auf einen Nanokristall hin. k Die Schrittgeschwindigkeit \(v\) bei verschiedenen Kombinationen von Hämatin- und H-ART-Konzentrationen, entsprechend den Morphologien in (j).

Die SEM-Beobachtungen der irreversiblen Hemmung stehen in scharfem Gegensatz zum aktuellen Verständnis der molekularen Mechanismen der Kristallisationshemmung und der Art und Weise, wie Antimalariamittel das Hämatinkristallwachstum beeinflussen. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass β-Hämatinkristalle durch die Keimbildung neuer Schichten wachsen, die sich durch den schrittweisen Einbau gelöster Moleküle ausbreiten7,32,33. Die Überwachung der Keimbildung und des Wachstums von Stufen auf β-Hämatin-Kristalloberflächen mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) bei der niedrigeren Hämatinkonzentration von 0,28 mM (am unteren Ende des physiologischen Bereichs6) ergab, dass die für diese Studie ausgewählten Antimalaria-Verbindungen eines davon verwenden zwei klassische Mechanismen zur Hemmung der β-Hämatin-Kristallisation5,15,26. H-ART, H-ARS und MQ adsorbieren an den Knickstellen und blockieren teilweise diese einzigartigen Stellen, an denen Hämatinmoleküle in Schritte eingebaut werden7. PY und CQ folgen einem alternativen Hemmmodus, dem Step-Pinning, bei dem Inhibitormoleküle an flachen Terrassen adsorbieren und das Stufenwachstum über weite Bereiche der Kristalloberfläche stoppen24,27. Die in den klassischen Mechanismen angenommene Reversibilität der Adsorption26,27 schreibt vor, dass ein Inhibitor, wenn er aus der Lösung entfernt wird, von den entsprechenden Oberflächenstellen desorbiert und das Stufenwachstum ungehemmt verläuft27. Die Reversibilität der β-Hämatin-Wachstumshemmung bei einer Hämatinkonzentration von 0,28 mM wurde dokumentiert5,7,15,26. Die Erholung des Stufenwachstums kann sich nach der Entfernung stark adsorbierender Inhibitoren verzögern. Wenn die Inhibitoren im Kristallgitter vergraben sind, setzt sich das Wachstum mit der gleichen Geschwindigkeit wie vor der Einwirkung des Inhibitors fort27. Wenn die Lösungskonzentration eines Inhibitors mit der des gelösten Stoffes vergleichbar ist, kann ein übermäßiger Inhibitoreinbau das Kristallgitter belasten und das Kristallwachstum über längere Zeiträume behindern28,29,30. Dieser letztere Mechanismus würde jedoch nicht auf die beobachtete irreversible Hemmung des β-Hämatin-Wachstums durch H-ARS, PY, CQ und MQ zutreffen, deren Konzentrationen, 10 μM und darunter, mindestens 50-fach niedriger sind als die von Hämatin , 0,5 mM, am oberen Ende des physiologischen Bereichs.

Wir haben von AFM untersucht, ob die irreversible Hemmung der β-Hämatin-Kristallisation auf einzigartige Verhaltensweisen zurückzuführen sein könnte, die durch die Inhibitoren bei Hämatinkonzentrationen von bis zu 0,5 mM ausgelöst werden. Wir haben untersucht, wie Hämatinkristalloberflächen und die Lösung, aus der Hämatinkristalle wachsen, auf die Einführung und Entfernung der fünf Antimalariamittel bei hoher Übersättigung reagieren. Bei moderaten Hämatinkonzentrationen von 0,28 mM oder weniger wirkt H-ART (Abb. 2a) ausschließlich als Kink-Blocker (Abb. 2b)5. In konzentrierteren 0,50 mM Hämatinlösungen zeigen zeitaufgelöste In-situ-AFM-Beobachtungen jedoch, dass die Einführung von 10 μM H-ART – vergleichbar mit Häm-Addukt-Konzentrationen in Trophozoiten, die Artemisininen ausgesetzt sind16 – die Ablagerung zahlreicher Hämatin-Nanokristalle verursacht (identifiziert anhand ihrer). charakteristischer Habitus, Abb. 1a) auf der (100)-β-Hämatin-Oberfläche (Abb. 2c). Im Gegensatz zu den Nanokristallen, die sporadisch in inhibitorfreien Lösungen bei ähnlichen Konzentrationen auftreten (Abb. 2d), wachsen die Nanokristalle in Gegenwart von H-ART nicht (Abb. 2e). In Übereinstimmung mit den zahlreichen durch AFM beobachteten Nanokristallen zeigt die Lichtstreuungsüberwachung von 0,5 mM Hämatinlösungen eine wachsende Kristallpopulation und eine erhebliche Beschleunigung der Kristallkeimbildung in Gegenwart von 10 μM H-ART (Abb. 2f – h). Sowohl bei metabolitenfreien als auch bei H-ART-reichen Lösungen zeigt die AFM-Überwachung abnehmende Trends der Schrittgeschwindigkeit \(v\), der Neuschicht-Keimbildungsrate \({J}_{2D}\) und der normalen Wachstumsrate der Fläche \(V\) mit steigender Hämatinkonzentration (Abb. 2i), ein offensichtlicher Verstoß gegen das Massenwirkungsgesetz. In metabolit- oder wirkstofffreien Lösungen die abnehmenden Segmente der \(v\), \({J}_{{{{{\rm{2D}}}}}}\) und \(V\)-Korrelationen mit \({c}_{H}\) wurden auf das Schrumpfen der Terrassen zurückgeführt (Abb. 2b), die als wesentliche Kanäle für den Transfer von Hämatinmolekülen von der Lösung zu den Stufen dienen33. Bei H-ART beginnen die abnehmenden Trends bei einer viel niedrigeren Hämatinkonzentration, wo die Terrassen breit sind (Abb. 2c, e). Wir korrelieren dieses stark kontraintuitive Verhalten mit der zunehmenden Keimbildung von Nanokristallen, die sich auf der Oberfläche ablagern und beim Wachstum des Kristalls in zufälligen Orientierungen im Kristall vergraben werden (Abb. 2c, e, j).

Die abnehmenden Kristallisationsraten zeigen, dass die vergrabenen Kristalle die treibende Kraft der Kristallisation verringern, wahrscheinlich indem sie den Kristall belasten und das chemische Potenzial der Hämatinmoleküle im Gitter erhöhen30,34,35. Um zu testen, ob die Abfolge der durch Metaboliten gesteuerten Nanokristall-Keimbildung, Ablagerung, Einbettung in den großen Kristall und höhere Gitterspannung zu einer irreversiblen Hemmung führt, haben wir zwei Hämatinkonzentrationen, 0,28 und 0,5 mM, mit entweder 0 oder 10 μM H-ART durchlaufen (Abb. 2j, k). Das Entfernen von H-ART stoppt die Keimbildung von Nanokristallen (Abb. 2j). Die vermutete Gitterspannung bleibt jedoch bestehen, nachdem der Metabolit entfernt wurde, und unterdrückt das β-Hämatin-Wachstum auch in Abwesenheit des Inhibitors (Abb. 2j).

Ähnlich wie H-ART blockiert adsorbiertes H-ARS reversibel den Zugang zu Knickstellen an β-Hämatinkristallen, die bei mäßiger Hämatinkonzentration wachsen5. Bei Einführung in 0,5 mM Hämatinlösungen löst H-ARS jedoch eine Reaktion aus, die nahezu identisch mit der von H-ART ist (ergänzende Abbildung 2). H-ARS führt zu einer reichlichen Keimbildung von Nanokristallen, die sich in größere β-Hämatinkristalle integrieren. Die erwartete Anhäufung von Gitterspannungen ist wahrscheinlich die Ursache für die unvollständige Wiederherstellung des Stufenwachstums, nachdem H-ARS aus der Lösung entfernt wurde.

Bei moderaten Hämatinkonzentrationen hemmt PY (Abb. 3a) das Wachstum von β-Hämatin, indem es die Stufen fixiert15. Die Hemmung des Stufenwachstums wird durch die Stabilisierung von Stufenpaaren verstärkt (Abb. 3b), die sich zu Stufenbündeln und Makroschritten entwickeln . PY steigerte die Keimbildung von Nanokristallen nicht und AFM zeigte keine Hinweise darauf, dass Nanokristalle das Wachstum größerer β-Hämatinkristalle störten (Abb. 3c). PY zeigte einen völlig anderen Mechanismus der irreversiblen Wachstumsunterdrückung. Bei erhöhten Konzentrationen gelöster Stoffe traten Schraubenversetzungen auf der Kristalloberfläche auf (Abb. 3d), wahrscheinlich als Folge des unvollständigen Verschlusses von Lösungseinschlüssen, die durch die Makroschritte erzeugt wurden (Abb. 3d). Die Versetzungen belasten das Gitter34; Darüber hinaus verzögert die hohe Dichte der von den Schraubenversetzungen ausgehenden Stufen die Stufenausbreitung, die Schichtbildung und die Kristallwachstumsrate aufgrund der schmaleren Terrassen, von denen die Stufen ausgehen, weiter (Abb. 3e – g). Durch die Entfernung von PY wird die Oberflächenwachstumsrate nicht auf ihren ursprünglichen Wert zurückgesetzt, da eine hohe Dichte sowohl an Stufen als auch an Versetzungen erhalten bleibt (Abb. 3h, i).

a Die Struktur von PY. b Schematische Darstellung der Stufenpaarstabilisierung durch PY. c, d AFM-Bilder von (100)-β-Hämatin-Kristalloberflächen bei \({C}_{H}\) = 0,28 mM, in (c) und nach der Zugabe von 4 μM PY, in (d). Beschriftungen in d vergrößern die eingekreisten Segmente d1 und d2, wo sich Makroschritte falten, um eine Versetzung zu erzeugen. e–g Die Korrelationen der Schrittgeschwindigkeit \(v\), der dimensionslosen Schrittdichte \(p\) und der Kristallwachstumsrate \(V\) mit \({C}_{H}\) in Gegenwart von 2 und 4 μM PY. Fehlerbalken umfassen zwei Standardabweichungen von den Durchschnittswerten von ca. 30 Messungen. h Stufenmuster auf der (100)-β-Hämatin-Kristalloberfläche bei den auf der Tafel angegebenen Hämatin- und PY-Konzentrationen. Pfeile zeigen Versetzungsaufschlüsse an, die sich als Zentren spiralförmiger Stufen manifestieren. i Die Schrittgeschwindigkeit \(v\) bei verschiedenen Kombinationen von Hämatin- und H-ART-Konzentrationen, entsprechend den Morphologien in (h).

Die Reaktion der Dynamik der β-Hämatin-Kristalloberflächen auf CQ (Abb. 4a), einen Stufenpinner (Abb. 4b)15, unterscheidet sich von der auf H-ART, H-ARS und PY. Im Gegensatz zu den beiden Artemisinin-Addukten führt ein Anstieg der Hämatinkonzentration in Gegenwart von CQ nicht zu einer übermäßigen Keimbildung von β-Hämatin-Nanokristallen im Wachstumsmedium (Abb. 4c). Darüber hinaus führt eine erhöhte Übersättigung zu einer höheren Schrittgeschwindigkeit (Abb. 4d, Stufe 3) und die Entfernung von CQ aus der Wachstumslösung führt zu einem progressiven Anstieg der Schrittgeschwindigkeit, sodass eine vollständige Wiederherstellung der Oberflächenwachstumsraten in ihren ursprünglichen Zustand beobachtet werden kann mehrere Minuten (Abb. 4d, Stufe 5). Die Wiederherstellung der Schrittgeschwindigkeit zeigt, dass die Wirkung von CQ auf die (100)-Seite von β-Hämatin vollständig reversibel ist, im krassen Gegensatz zu den einzigartigen Verhaltensweisen von H-ART, H-ARS und PY. Die Stufenbildung und das Wachstum auf der (100)-Seite von β-Hämatin reagieren auf eine hohe Übersättigung und das Vorhandensein von MQ, einem Knickblocker, analog zur Reaktion auf CQ (ergänzende Abbildung 3). Insbesondere fördern MQ und CQ nicht die Keimbildung von Hämatin-Nanokristallen oder die Bildung von Stufenbündeln und Makrostufen.

a Die Struktur von CQ. b Schematische Darstellung der Stufenhemmung durch Stufenpinner, die auf den Terrassen zwischen den Stufen adsorbieren und so die Stufen zwingen, sich zu biegen, um zwischen den beiden Pinnern zu wachsen. Wenn der Abstand zwischen zwei Pinnern Δx kürzer ist als der kritische zweidimensionale Durchmesser \(2{R}_{{{{{\rm{crit}}}}}}\, hört das Stufenwachstum auf. Wenn Δx länger, aber vergleichbar mit \(2{R}_{{{{{\rm{crit}}}}}}\ ist, verzögert sich das Schrittwachstum. c Stufenmuster auf der (100)-β-Hämatin-Kristalloberfläche bei den auf den Tafeln angegebenen Hämatin- und CQ-Konzentrationen. d Die Schrittgeschwindigkeit \(v\) bei verschiedenen Kombinationen von Hämatin- und CQ-Konzentrationen, entsprechend den Morphologien in (c).

Ein Vergleich der Reaktionen auf Knickblocker (H-ART, H-ARS und MQ) mit denen auf PY und CQ, zwei Inhibitoren, die an den Terrassen adsorbieren, zeigt, dass die Reversibilität eines Modifikators nicht mit seinem Hemmmechanismus korreliert. Vielmehr kann die Hemmung bestehen bleiben, nachdem der Inhibitor entfernt wurde, wenn er kooperative Reaktionen wie Kristallkeimbildung/-ablagerung oder Makrostufenbildung auslöst, die sich dauerhaft auf den wachsenden Kristall auswirken und das Wachstum unterdrücken.

Die durch H-ART, H-ARS und PY aktivierten molekularen Mechanismen zur irreversiblen Hemmung der {100}-Seiten von β-Hämatin legen mögliche Wege nahe, denen Antimalariamittel folgen könnten, um die {011}- und {010}-Seiten zu hemmen. Die durch H-ARS geförderte Keimbildung von Nanokristallen und deren Einbau außerhalb der Registrierung in wachsende Kristalle ist wahrscheinlich die Ursache für die irreversible Hemmung der {011}- und {010}-Flächen. Andererseits verstärken PY, CQ und MQ die Kristallkeimbildung nicht, daher können diese Antimalariamittel die {011}- und {010}-Flächen irreversibel hemmen, indem sie die Stufendynamik stören, ähnlich den Auswirkungen von PY auf die {100} Gesichter.

Wir haben getestet, ob die irreversible Hemmung der Hämatinkristallisation mit der dosis- und zeitabhängigen Unterdrückung des Malariaparasitenwachstums durch den Inhibitor korreliert. Selbst wenn ein Metabolit oder ein Medikament nur eine der Hämatinkristallflächen irreversibel hemmt (Abb. 1a), verzögert es dennoch die Sequestrierung von Hämatin und trägt zur Akkumulation von Porphyrin bei, das kontinuierlich durch die Hämoglobinverdauung produziert wird. Daher gehen wir davon aus, dass die fünf hier getesteten Verbindungen eine irreversible Unterdrückung von Malariaparasiten bewirken.

Wir haben uns für den P. falciparum-Stamm NF54 entschieden, der gegenüber den meisten Antimalariamitteln empfindlich ist, und das Alter aller Parasiten in der Kultur sorgfältig synchronisiert. Wir setzten die Parasiten 3- oder 6-stündigen Impulsen verschiedener Arzneimittelkonzentrationen aus, die auf ein Vielfaches der halbmaximalen Hemmkonzentration für eine 72-stündige kontinuierliche Exposition gegenüber einem Metaboliten oder Arzneimittel eingestellt wurden (IC50, ergänzende Abbildung 4). Wir haben die Parasiten in metabolit- oder drogenfreien Medien gewaschen und inkubiert (Abb. 5a). Wir haben den Anteil der überlebenden Parasiten mithilfe von radioaktivem [3H] Hypoxanthin, einem Biomarker für die DNA-Replikation, gemessen. Hypoxanthin ist eine Purin-Nukleobase, die in neu geschaffene DNA eingebaut wird, wenn ein Parasit seine Replikation am Ende des zweiten Tages seines Erythrozyten-Lebenszyklus beginnt. Das radioaktive Signal am Ende einer 72-stündigen Inkubation skaliert die DNA-Replikation mit dem Anteil der überlebenden Parasiten36,37.

a Schematische Darstellung eines Arzneimittelpulstests mit [3H]-Hypoxanthin-Nachweis zum Nachweis des Parasitenüberlebens. b Anteil der Parasiten, die nach der Synchronisierung ihrer Lebenszyklen 72 Stunden lang überlebten. Die Konzentrationen beziehen sich auf den im jeweiligen Feld angegebenen Inhibitor. Die Parasiten wurden 6 Stunden lang H-ART, H-ARS, PY, CQ und MQ ausgesetzt, die nach 0, 5, 24 und 29 Stunden ihres Lebens eingeführt wurden. Diese Parasitenalter entsprechen jungen Parasiten im Ringstadium, alten Parasiten im Ringstadium, jungen Trophozoiten bzw. alten Trophozoiten. Die Legende befindet sich im MQ-Panel. Dünne vertikale Linien und angrenzende Zahlen kennzeichnen unabhängig voneinander gemessene, kontinuierliche IC50-Inhibitorwerte, die Konzentration eines Medikaments, das 50 % der Parasiten bei einer 72-stündigen Inhibitorexposition hemmt. Diese horizontalen Linien markieren die Überlebensrate des Parasiten von 50 %. Horizontale Klammern und angrenzende Zahlen bezeichnen das Verhältnis der Inhibitorkonzentrationen, die 50 % der Parasiten jedes Alters in einem 6-Stunden-Puls unterdrücken, zum kontinuierlichen IC50-Wert des Arzneimittels.

Um zu unterscheiden, ob die Inhibitoraktivität mit der Hemozoin-Unterdrückung zusammenhängt, haben wir die Arzneimittelimpulse in vier Parasitenaltern eingeleitet, die sich durch das Stadium der Hämozoin-Kristallisation unterscheiden (Abb. 5a): junge Ringe, bei denen das Hämozoin zu keimen beginnt, alte Ringe, wenn das Hämozoin beginnt Kristalle sind klein, und es gibt junge und alte Trophozoiten, in denen bei unbehandelten Parasiten die Hämozoinkristalle wachsen6. Alle Verbindungen außer PY, die in junge Ringe eingeführt und 6 Stunden später entfernt werden, hemmen das Parasitenwachstum wesentlich weniger als wenn sie in späteren Parasitenstadien eingeführt werden (Abb. 5b). Die schwächere Inhibitoraktivität im Parasitenalter, wenn nur wenige und kleine Hämozoinkristalle vorhanden sind, steht im Einklang mit der Hemmung des Hämozoinwachstums als Hauptweg der Inhibitorwirkung. Darüber hinaus protonieren alle fünf Verbindungen teilweise, wenn sie in die Verdauungsvakuole eindringen, um sich an deren pH-Wert (ca. 5,038) anzupassen, der niedriger ist als der von Blut und dem Erythrozytenzytosol (ca. 7,35), unterliegen aber keinen weiteren chemischen Veränderungen13,17,39. Daher lässt die schwache Reaktion auf Inhibitorimpulse, die auf junge Ringe angewendet werden, darauf schließen, dass die Verbindungen in späteren Parasitenstadien nicht zurückgehalten werden und wahrscheinlich aus der Verdauungsvakuole wandern.

Gestützt auf das Verhältnis der Einwirkungszeiten des Inhibitors, 72 und 6 Stunden, definieren wir die Parasitenunterdrückung durch einen Inhibitor als irreversibel, wenn die Konzentration, bei der ein 6-stündiger Arzneimittelimpuls das Parasitenwachstum um die Hälfte hemmt, niedriger als das 12-fache seines IC50-Werts ist. die Konzentration, die 50 % des Parasitenwachstums über 72 Stunden kontinuierlicher Arzneimittelexposition hemmt. Die Anwendung dieses Kriteriums auf die Trophozoiten-Überlebensfraktionen nach 6-Stunden-Pulsen (Abb. 5b und Ergänzungstabelle 2) zeigt, dass die H-ART- und H-ARS-Addukte (5–11) × IC50 für eine 50% ige Trophozoitenhemmung erforderten, während die Chinoline erforderlich waren ca. (2–6) × kontinuierlicher IC50. PYR erreichte eine 50-prozentige Hemmung des Ringstadium-Impulses bei 2 × IC50, wobei CQ 10 × IC50 für die Ringstadium-Hemmung benötigte, während MQ die Ringe nicht hemmte. CQ und H-ART hatten einen Puls-IC50-Bereich für alle Stadien im Fünf- bis Neunfachbereich mit einer Änderung der Steigung für junge Ringe, H-ARS 10–11× für alle außer jungen Ringen bei 17×, MQ mit Trophozoitenstadien von zweifaches Verhältnis ohne Hemmung der Ringe. Die Fähigkeit von MQ, Hämozoinkristalle zu hemmen, könnte ein sekundärer Mechanismus der Proteinsynthese oder der Hemmung der Purinnukleosidphosphorylase von P. falciparum sein40,41,42. PY hatte ein IC50-Verhältnis von 2× für Ringe, 5× für junge Trophäen und 9× für alte Trophozoiten.

Im Allgemeinen unterdrückten alle getesteten Wirkstoffe die Parasitenpopulationen irreversibel, wenn sie im Trophozoitenstadium oder, im Fall von PY, auch im frühen Ringstadium angewendet wurden. PY-Impulse sind am effektivsten, wenn sie auf junge Ringe angewendet werden, was darauf hindeutet, dass PY die Keimbildung von Hämozoinkristallen verzögern kann, was mit den AFM-Beobachtungen der β-Hämatinkristallisation übereinstimmt (Abb. 3c, d, h).

Beachten Sie, dass sich dieser Pulstest von den Artemisinin-Ringstadium-Pulstests unterscheidet, bei denen die Aktivität von Artemisinin-Arzneimitteln auf Ringstadien genetisch unterschiedlicher Malariaparasiten untersucht wird. Hier verglichen wir verschiedene Verbindungen auf einem einzelnen P. falciparum-Isolat in vier verschiedenen Stadien.

Die 3-stündigen Metaboliten- oder Arzneimittelimpulse verdoppelten ungefähr die IC50-Werte und das Faltverhältnis, mit Ausnahme von PY, das ungefähr gleich war (ergänzende Abbildung 5). Die Migration der Verbindungen aus der Verdauungsvakuole, die durch die schwachen Reaktionen von Parasiten im Ringstadium nahegelegt wird, bedeutet, dass die Wirksamkeit kurzfristiger Metaboliten- oder Arzneimittelimpulse nicht auf der verbleibenden Inhibitormenge beruht. Somit ist die starke Unterdrückung durch 3- und 6-stündige Exposition gegenüber Arzneimitteln mit einer irreversiblen Unterdrückung der Hämozoinkristallisation verbunden, was zu einer Hämatinakkumulation oberhalb der Toxizitätsgrenze des Parasiten führt.

Wir zeigen, dass Antimalariamittel zwei Mechanismen mobilisieren, um das β-Hämatin-Wachstum irreversibel zu unterdrücken, selbst nachdem der Metabolit oder die Medikamente aus der Wachstumslösung entfernt wurden. In beiden Fällen wird die Irreversibilität wahrscheinlich durch Spannungen im Kristallgitter erzwungen. Diese Spannung entsteht durch die Kooperativität von Molekülen, die die Keimbildung von Nanokristallen fördert, die sich in β-Hämatinkristalle einbauen, oder zwischen Wachstumsschritten, die sich zu Makroschritten zusammenballen und zahlreiche Versetzungen erzeugen. Beide kooperativen Wirkungsweisen werden durch hohe Abweichungen vom Gleichgewicht getrieben. Der neu entdeckte Zusammenhang zwischen der irreversiblen Kristallisationshemmung und der irreversiblen Unterdrückung von Malariaparasiten legt nahe, dass die irreversible Hemmung der Hämatinkristallisation für die Antimalaria-Antiparasitenaktivität von wesentlicher Bedeutung sein könnte. Im Zusammenhang mit der Kristallsynthese deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Kristallgrößen, Größenverteilungen, Seitenverhältnisse und andere für zahlreiche Bereiche wesentliche Eigenschaften durch die Verstärkung oder Einschränkung kooperativer Verhaltensweisen gesteuert werden können, die eine irreversible Unterdrückung des Kristallwachstums und von Malariaparasiten bewirken.

Die folgenden Verbindungen wurden von Sigma Aldrich gekauft: Schweinehämatin (≥ 98 %), Zitronensäure (wasserfrei, ≥ 99,5 %), Natriumhydroxid (wasserfrei, ≥ 98 %), n-Octanol (wasserfrei, ≥ 99 %), Schweinehämatin , Artemisinin (≥ 98 %), Artesunat (wasserfrei, ≥ 98,0 %), CQ-Diphosphat (≥ 98 %), MQ-Hydrochlorid (wasserfrei, ≥ 98,0 %). Sorbit, PY-Tetraphosphat (\(\ge \, \)95 %), Hypoxanthin, Saponin, Natriumdodecylsulfat (SDS), Bicarbonat, Natriumbicarbonat (NaHCO3, Hypoxanthin und HEPES. Die folgende Chemikalie wurde von ThermoFisher Scientific gekauft: RPMI 1640 Medien, ergänzt mit L-Glutamin und Gentamycin. Humanserum wurde von der zwischenstaatlichen Blutbank bezogen. Alle Reagenzien wurden wie erhalten ohne weitere Reinigung verwendet, sofern nicht anders angegeben. Alle Materialien wurden wie erhalten verwendet. Deionisiertes (DI) Wasser wurde durch eine Millipore-Reverse hergestellt Osmose-Ionenaustauschsystem (Rios-8 Proguard 2–MilliQ Q-guard).

Zitronensäurepuffer mit einem pH-Wert von 4,8 wurde hergestellt, indem 50 mM Zitronensäure in entionisiertem Wasser gelöst und die Lösung unter kontinuierlichem Rühren mit der Zugabe von 0,10 M NaOH titriert wurde, um den gewünschten pH-Wert zu erreichen, der vor jedem Experiment mit einem Accumet Basic pH-Meter überprüft wurde ( Thermofisher Scientific). Jeden Monat wurden frische Puffer hergestellt und bei Umgebungsbedingungen gelagert. Wir brachten 5 ml Zitronenpuffer (pH 4,8) bei Raumtemperatur in direkten Kontakt mit n-Octanol und ließen 30 Minuten Zeit für die Äquilibrierung. Der obere Teil des Zweiphasensystems wurde dekantiert und als mit Zitronensäurepuffer gesättigtes Octanol (CBSO) bezeichnet. Hämlösungen wurden hergestellt, indem Hämpulver in 8 ml frisch hergestelltem CBSO gelöst und 7–9 Stunden lang auf 70 °C erhitzt wurde. Die Lösung wurde durch einen 0,2-μm-Nylonmembranfilter (ThermoFisher Scientific) filtriert und die Konzentration mithilfe eines zuvor berichteten7 Extinktionskoeffizienten von 3,1 ± 0,1 cm−1 mM−1, gemessen bei einer Wellenlänge von λ = 594 nm, bestimmt.

Hämatinlösungen wurden nach einer modifizierten Methode unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie oben hergestellt, jedoch über den Ersatz von n-Octanol durch n-Butanol. Natriumdithionit bei ca. 1 mM und Artemisinin (ART) bei ca. 1 mM wurde in entionisiertem Wasser bzw. n-Butanol gelöst. Die Hämlösung wurde mit einem 0,2-μm-Nylonmembranfilter filtriert und in einem Glasfläschchen mit der Dithionitlösung in Kontakt gebracht, um ein Nettomolverhältnis von 1:2:5 Häm:ART:Natriumdithionit zu ergeben. Das Fläschchen wurde unter einem Stickstoffgasstrom verschlossen, um eine inerte Atmosphäre zu schaffen. Die Reaktion umfasste die Reduktion von Eisen(III) zu Eisen(II) in Hämatin, wobei Dithionit als Reduktionsmittel fungierte. Das System wurde mithilfe eines Wasserbads (Super-Nuova Multi-Position Digital Stirring Hotplates) auf 50 °C gehalten. Die wässrige und die organische Phase wurden durch ca. 30-minütiges Schütteln kräftig vermischt. 30 s, bis sich die Farbe der Lösung von dunkelgrün nach rosa änderte, was auf die Reduktion von Hämatin (enthält Fe(III)) zu Häm (enthält Fe(II)) hinweist. Die Mischung wurde mindestens 30 Minuten lang unter statischen Bedingungen gehalten, um die Trennung der organischen und wässrigen Phasen zu ermöglichen. Anschließend wurde die Artemisinin-Lösung in die organische (obere) Fraktion injiziert. Die Reaktion zwischen Häm und Artemisinin erfolgte unmittelbar nach der Injektion, was anhand der augenblicklichen Farbänderung von Rosa nach Orange zu erkennen war. Nachdem ca. 30 Minuten, bis die Reaktion abgeschlossen war, wurde die organische Schicht zur späteren Reinigung des Produkts, Häm-Artemisinin-Addukt (oder H-ART), gesammelt.

Das Verfahren zur Synthese des Häm-Artesunat-Addukts (H-ARS) war identisch mit dem von H-ART, wobei ART durch Artesunat (ARS) ersetzt wurde. Es wurde das gleiche Reaktionsverfahren verwendet, mit dem einzigen nennenswerten Unterschied, dass die Reaktion zur Bildung von H-ARS schneller ablief, was durch einen schnelleren Farbwechsel nach der Zugabe von ARS zur Häm(II)-Lösung zu erkennen war.

Weitere Einzelheiten zu den Verfahren zur Reinigung und Identifizierung von H-ART und H-ARS mittels Massenspektroskopie finden Sie in Ref. 5.

Eine Hämatin-Wachstumslösung wurde hergestellt, indem Hämatinpulver in 8 ml frisch hergestelltem CBSO gelöst und anschließend 7–9 Stunden lang auf 70 °C erhitzt wurde. Die Lösung wurde unter Umgebungsbedingungen auf Raumtemperatur abgekühlt und mit einem 0,2-μm-Nylonmembranfilter filtriert. Die Konzentration wurde mit einem Extinktionskoeffizienten \({\varepsilon }_{{{{{\rm{heme}}}}}}=3,1\pm 0,1\,{{{{{{\rm{cm}}} bestimmt. }}}}^{-1}\,{{{{{{\rm{mM}}}}}}}^{-1}\,{{{{{\rm{at}}}}}} \,\lambda =594\,{{{{{\rm{nm}}}}}}\). Die Hämatinlösung wurde dann mit frischem CBSO verdünnt, um eine Endkonzentration von 0,20 μM zu erreichen. Ein Stück Deckglas, das mit mehreren Wasser-Ethanol-Wasser-Zyklen gereinigt wurde, wurde auf den Boden eines Glasfläschchens gelegt und in Häm-Wachstumslösung eingetaucht. Glasfläschchen wurden mit verschlossenen Septenkappen verschlossen und auf einer stationären Plattform im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert. Nach 2–3 Tagen erschienen auf den Glasobjektträgern kleine Kristalle, die nach zwei Wochen eine maximale Größe (ca. 20 μm) erreichten. Die Kristalle enthaltenden Glasobjektträger wurden vor der Analyse mit Ethanol und entionisiertem Wasser gespült und an der Luft getrocknet.

Die Experimente wurden mit einem Multimode-Nanoskop VIII und einem Rasterkraftmikroskop (AFM) IV von Digital Instruments durchgeführt. AFM-Bilder wurden im Klopfmodus (d. h. bei leichtem Eingriff) mit Olympus TR800PSA-Sonden (Siliziumnitrid, Cr/Au-beschichtet 5/30, Federkonstante 0,15 N m−1) mit einer Frequenz von 32 kHz aufgenommen. Bilder wurden mit Scangrößen von 0,3–20 μm, Scanraten von 0,5–2,5 s−1, 256 Scanlinien und verschiedenen Scanwinkeln abhängig von der Ausrichtung des Kristallsubstrats erhalten. Die Temperatur in der Flüssigkeitszelle erreichte innerhalb von 15 Minuten nach der Bildgebung einen konstanten Wert von 27,8 ± 0,1 °C15. Dieser Wert war aufgrund der Erwärmung durch den Betrieb des AFM-Scanners höher als die Raumtemperatur. Die Dichte der Hämkristallsubstrate, die auf Glasscheiben gezüchtet wurden (wie oben beschrieben), wurde mit einem optischen Mikroskop überwacht, um sicherzustellen, dass für alle Proben eine gleiche Anzahl an Kristallen vorhanden ist (d. h. um eine potenzielle Erschöpfung an freiem Häm und Wachstumsinhibitor aufgrund der großen Gesamtoberfläche zu minimieren). Kristalle). Die Glasobjektträger wurden auf AFM-Probenscheiben (Ted Pella) montiert und die Proben auf den AFM-Scanner gelegt. Übersättigte Hämlösungen in CBSO wurden weniger als 2 Stunden im Voraus hergestellt. Die Wachstumslösung wurde mit einer 1-ml-Einwegspritze aus Polypropylen (Henck Sass Wolf), die gegenüber organischen Lösungsmitteln tolerant ist, in die AFM-Flüssigkeitszelle geladen. Nach dem Beladen wurde das System 10–20 Minuten lang stehen gelassen, um sich thermisch auszugleichen. Die Kristallkanten in optischen Mikroaufnahmen wurden identifiziert, um die Orientierung und die kristallographischen Richtungen auf der nach oben gerichteten (100)-Kristalloberfläche zu bestimmen. Die Kristalle wurden 0,5–1,5 Stunden lang mit der Lösung in Kontakt gehalten, damit sich ihre Oberflächeneigenschaften an die Wachstumsbedingungen anpassen konnten.

Die Scanrichtung wurde parallel zur kristallographischen [001]-Richtung eingestellt und AFM-Bilder wurden 3–5 Stunden lang aufgenommen. Die Lösung in der AFM-Flüssigkeitszelle wurde alle 30 Minuten ausgetauscht, um eine annähernd konstante Häm-Konzentration (ein Inhibitor) aufrechtzuerhalten. Für Studien zu Antimalariamitteln wurden Wachstumslösungen durch solche ersetzt, die eine ausgewählte Inhibitorkonzentration enthielten. Für jeden Assay ließ man die Kristallsubstrate zunächst in Wachstumslösung ohne zugesetzten Inhibitor äquilibrieren (ca. 30 Minuten), bevor Lösungen zugegeben wurden, die den Inhibitor enthielten. Für Studien zur Bewertung der irreversiblen Hemmung wurde der AFM-Flüssigkeitszelle zu periodischen Bildgebungszeiten eine Reihe von Lösungen mit unterschiedlichen Häm- und/oder Inhibitorkonzentrationen zugeführt. Bei allen In-situ-Messungen wurde das Wachstum von Hämkristalloberflächen durch zweidimensionale (2D) Schichterzeugung und -ausbreitung durch die Schrittgeschwindigkeit v (nm/s) und die Rate der 2D-Keimbildung neuer Kristallschichten J2D (nm) charakterisiert −2 s−1) unter Verwendung der angegebenen Protokolle15. Kurz gesagt bestimmen wir v, indem wir die Verschiebungen von 8–13 einzelnen Stufen mit einer gemessenen Stufenhöhe \(h\) = 1,17 ± 0,07 nm (entsprechend der Einheitszellendimension in a-Richtung) überwachen. Für jeden einzelnen Schritt wurden etwa 25–35 Messungen durchgeführt und die durchschnittlichen Schrittgeschwindigkeiten durch Analyse aufeinanderfolgender Bilder über die Zeit ermittelt. Um J2D zu bestimmen, wurde das Auftreten neuer Inseln auf der Oberfläche zwischen aufeinanderfolgenden Bildern überwacht und die Anzahl der gewachsenen Inseln gezählt. Diese Zahl wurde mit dem Scanbereich und dem Zeitintervall zwischen den Bildern skaliert, um J2D zu erhalten (bewertet aus dem Durchschnitt von 15–25 Messungen).

Unter den meisten hier getesteten Bedingungen bilden sich mehrere Kerne gleichzeitig und verschmelzen, um das Gesicht zu bedecken. Unter diesen Bedingungen43 wird die Kristallwachstumsrate \(V\) in Richtung normal zur beobachteten Fläche als \(V\cong {\lambda }^{2}{J}_{2D}\,h\,\cong berechnet \,h{({v}^{2}{J}_{2D})}^{1/3}\) wobei \({{{{{\rm{\lambda }}}}}}={ \left(v/{J}_{2D}\right)}^{1/3}\) ist der Abstand zwischen einzelnen Kernen33. In Gegenwart von PY sind Hämatinkristalloberflächen mit Reihen paralleler Stufen bedeckt. Die Keimbildung neuer Schichten kann nicht beobachtet und \({J}_{2D}\) nicht gemessen werden. Wir messen die dimensionslose Stufendichte \(p=h/l\), wobei \(l\) der Abstand zwischen den Stufen ist. Die normale Wachstumsrate \(V\) wird als \(V={pv}\) bewertet.

Dynamische Lichtstreuungsdaten wurden mit einem ALV-Instrument (ALV-GmbH, Deutschland) gesammelt, das ein ALV-Goniometer, einen He-Ne-Laser mit einer Wellenlänge von 632,8 nm und einen digitalen Multiple-Tau-Korrelator ALV-5000/EPP umfasst. Normalisierte Intensitätskorrelationsfunktionen \(G(q,\tau)\) wurden 60 Sekunden lang bei einem festen Streuwinkel von 90° erfasst. Die charakteristische Diffusionszeit \({\tau }_{c}\) für Hämatinkristallite und die entsprechende Amplitude \({A}_{c}\) (die proportional zur von den Kristalliten gestreuten Intensität ist) wurden durch Anpassung berechnet \(G(q,\tau )\) mit einer exponentiellen Beziehung44,45 \(G\left(q,\tau \right)-1={({A}_{c}{{\exp }}\left (-\tau /{\tau }_{c}\right))}^{2}+\varepsilon (\tau )\), wobei \(\varepsilon (\tau )\) das Hintergrundrauschen in der Korrelationsfunktion ist .

Hämatinkristalle wurden wie oben beschrieben in einer Konzentration von 0,50 mM in Gegenwart eines Antimalariamedikaments gezüchtet. Die Inhibitorkonzentrationen betrugen 10 μM für H-ART, H-ARS und PY; 2 μM für CQ; und 5 μM für MQ. Drei Glasobjektträger wurden in die Wachstumslösung eingelegt. Nach drei Tagen wurden auf den Objektträgern kleine β-Hämatinkristalle beobachtet. Einer der Objektträger wurde in eine frisch zubereitete Lösung mit denselben Komponenten wie die zuvor aufgetragene Lösung überführt und ein anderer wurde in eine metabolit- oder arzneimittelfreie Lösung mit derselben Hämatinkonzentration, 0,50 mM, überführt. Diese Kristalle wuchsen noch 10 Tage lang. Als Referenz wurden Kristalle auf dem dritten Objektträger aufbewahrt. Zur Kontrolle wurden die Kristalle drei Tage lang ohne Zusatzstoffe gezüchtet und dann einer der Objektträger in eine frische Lösung ohne Zusatzstoffe mit derselben anfänglichen Hämatinkonzentration überführt. Die Objektträger mit den Kristallen wurden extrahiert, getrocknet und mit REM abgebildet. Hierzu wurden die Objektträger mit entionisiertem Wasser gespült und mit reinem Ethanol getrocknet. Die Objektträger und der daran befestigte Kristall wurden mit 15 nm Gold beschichtet. Die Breiten und Längen von mindestens 30 Kristallen, die bei jeder Lösungszusammensetzung und jedem Inhibitorregime gewachsen waren, wurden gemessen und gemittelt.

Um zu beurteilen, ob die Hemmung reversibel ist, verglichen wir die Längen- und Breitenzuwächse dieser Kristalle während der zusätzlichen 10 Tage des Metaboliten- oder Medikamenten-freien Wachstums mit den äquivalenten Zuwächsen der Kristalle, die 13 Tage lang entweder in reinen Lösungen wuchsen (kurze gestrichelte graue Linie). in Abb. 1d) oder in Gegenwart der gleichen Inhibitorkonzentrationen (langgestrichelte orangefarbene Linie in Abb. 1d). Eine irreversible Hemmung würde sich in Längen- und Breitenzuwächsen der ersten Kristallgruppe äußern, die kürzer sind als die von Kristallen, die nie Inhibitoren ausgesetzt waren (Kriterium 1) und mit denen von Kristallen vergleichbar sind, die 13 Tage lang in Gegenwart von Inhibitoren gewachsen sind ( Kriterium 2).

Eine größere Anzahl von Kristallen und größere Kristalldimensionen in einer der Populationen im Vergleich zu den Kriterien 1 und 2 können zu einem schnelleren Verbrauch gelöster Stoffe und einer geringeren Übersättigung bei längeren Wachstumszeiten führen, was zu kürzeren Längen und Breiten führt, die nicht durch die Inhibitoraktivität verursacht werden. Kriterium 1 vergleicht die durchschnittlichen Längen- und Breitenzuwächse zweier Kristallpopulationen, die in den ersten drei Tagen in Gegenwart bzw. Abwesenheit eines Inhibitors wuchsen. Die Einführung einer frischen Lösung, in der die Hämatinkonzentration gleich den anfänglichen 0,50 mM ist, minimiert die Auswirkungen auf die Übersättigungsentwicklung einer möglicherweise ungleichen Anzahl von Kristallen aufgrund einer durch den Inhibitor induzierten schnelleren oder langsameren Keimbildung. Die Kristalle, die in den ersten drei Tagen in Gegenwart eines Inhibitors wuchsen, waren im Durchschnitt entweder etwa gleich groß oder kürzer und dünner als die Kristalle, die in inhibitorfreien Lösungen wuchsen (Abb. 1e). Dementsprechend wäre der Verbrauch gelöster Stoffe in der zweiten Lösung ähnlich dem in den Fläschchen mit Kristallen, die ursprünglich in hemmstofffreien Lösungen wuchsen, oder langsamer. Die Übersättigung in den späteren Wachstumsstadien wäre gleich oder höher als die in den Fläschchen mit Kristallen, die ursprünglich in hemmstofffreien Lösungen wuchsen. Daher erscheint es unwahrscheinlich, dass eine geringere Übersättigung während des sekundären Kristallwachstums die Zunahme der Kristalldimensionen über die Unterdrückung hinaus aufgrund irreversibler Inhibitoreffekte verzögern kann.

Kriterium 2 vergleicht die Zunahme der durchschnittlichen Länge und Breite von Kristallpopulationen, die unter identischen Bedingungen gebildet wurden, sodass die Anzahl der Kristalle und die Kristallabmessungen zu Beginn des 10-tägigen Wachstums ungefähr gleich sind. Die ungefähren gleichen Kristallzahlen und -abmessungen in diesen beiden Populationen stellen sicher, dass die Übersättigung während des Kristallwachstums ungefähr gleich bleibt. Daher sind die beobachteten Unterschiede in der durchschnittlichen Kristalllänge und -breite auf die irreversible Hemmung durch Antimalariamittel zurückzuführen.

Für diese Studie haben wir Blut von Lebendspendern gewonnen, die für die Forscher nicht identifizierbar sind. Menschliche Erythrozyten werden von gesunden Freiwilligen gemäß den vom Johns Hopkins IRB genehmigten Protokollen gewonnen.

CQ-Diphosphat (C-6628, Sigma Aldrich) und PY-Tetraphosphat (sc-205828A, Chem Cruz) wurden in sterilem H20 für Zellkulturen gelöst. H-ART- und H-ARS-Addukte, synthetisiert wie oben beschrieben, und MQ-Hydrochlorid (M2319, Sigma Aldrich) wurden in DMSO (D128500, ThermoFisher) gelöst. Zur Verwendung in Parasitentests haben wir alle getesteten Verbindungen und Addukte in hemmstofffreien Kulturmedien weiter verdünnt, um sicherzustellen, dass der DMSO- oder H2O-Gehalt beim Einbringen in die Parasitenkultur nie eine Endkonzentration von über 1 % erreicht.

In-vitro-Experimente umfassten P. falciparum NF54 (MRA-1000), das von BEI Resources bezogen wurde. Parasitenkulturen wurden nach einer Modifikation der Trager- und Jensen-Methode46 gepflegt. Insbesondere wurden Parasiten bei 2 % Hämatokrit in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit L-Glutamin, 25 mM HEPES, 0,25 % NaHCO3, 0,37 mM Hypoxanthin, 50 µL 50 mg/ml Gentamycin und 10 % Humanserum, kultiviert. Die Kulturen wurden bei 37 °C in 5 % CO2/5 % O2/ausgewogenem N2 inkubiert.

Um den IC50-Wert für jeden Inhibitor zu bestimmen, wurden P. falciparum-Kulturen durch Inkubation in 5 % Sorbitol auf das Ringstadium synchronisiert. Die Parasitämie wurde durch optische Mikroskopie eines mit Giemsa gefärbten Blutausstrichs beurteilt. Der IC50-Wert wurde mithilfe einer modifizierten Version des [3H]-Hypoxanthin-Einbautests37 bestimmt. Jede Inhibitorkonzentration wurde in drei technischen Replikaten durchgeführt. Negative Wachstumskontrollvertiefungen enthielten 10 μM CQ. Die Vertiefungen zur positiven Wachstumskontrolle enthielten hemmstofffreie Kulturmedien. Parasitenkulturen wurden in mit Gewebekultur behandelten 96-Well-Platten (353072, Falcon) bei 2 % Hämatokrit und 0,5 % Parasitämie in einem Endvolumen von 200 μl Hypoxanthin-freiem Komplettmedium ausplattiert. Parasitenkulturen wurden kontinuierlich 72 Stunden lang bei 37 °C mit einem Inhibitor inkubiert. Zum Zeitpunkt der Inkubation mit dem Inhibitor wurden jeder Vertiefung 0,5 μCi [3H]-Hypoxanthin zugesetzt. Nach Abschluss der Inkubationszeit wurden 96-Well-Platten bei –80 °C eingefroren, bis sie zur Probenernte bereit waren. Die 96-Well-Platten wurden aufgetaut und die Proben wurden mit einem Zellernter (MB48, Brandel) auf Glasfaserfiltern (GF/C, Brandel) geerntet. Der Einbau von [3H]-Hypoxanthin wurde mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen. Das Parasitenwachstum wurde durch Vergleich der Zerfälle pro Minute (DPMs) der Kontrollvertiefungen mit denen der Testvertiefungen bestimmt. IC50-Kurven und -Werte wurden mithilfe einer nichtlinearen Regressionsanalyse (Log (Inhibitor) vs. Reaktion) in der GraphPad Prism 9-Software erstellt (Extended Data Abb. 5).

P. falciparum-Kulturen wurden durch Inkubation in 5 % Sorbit 48 Stunden vor und unmittelbar vor dem Beginn des jungen Ringpulses auf das Ringstadium synchronisiert. H-ART, H-ARS, CQ, PY und MQ wurden bei Konzentrationen von 0 bis 500 nM auf synchronisierten Kulturen im jungen Ringstadium 3 oder 6 Stunden lang gepulst, dreimal in Kulturmedien ohne Hypoxanthin gewaschen und dann zur vollständigen Kultur zurückgeführt Medien und inkubiert bei 37 °C mit 0,5 μCi [3H]-Hypoxanthin zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Der alte Ringpuls wurde 5 Stunden nach dem jungen Ringpuls eingeleitet, der junge Trophozoitenpuls wurde 24 Stunden nach dem jungen Ringpuls eingeleitet und der alte Trophozoitenpuls wurde 29 Stunden nach dem jungen Ringpuls eingeleitet. Die vollständige Methode ist in Abb. 5a grafisch dargestellt. Negative Wachstumskontrollvertiefungen enthielten 10 μM CQ. Positive Wachstumskontrollvertiefungen enthielten Metaboliten- oder wirkstofffreie Kulturmedien. Das Parasitenwachstum wurde durch Vergleich der DPMs der Kontrollvertiefungen mit denen der Testvertiefungen bestimmt.

Die durchschnittlichen Längen und Breiten der Kristalle, die zum Testen der Auswirkungen von Arzneimitteln und Metaboliten auf die Massenkristallisation verwendet werden (Abb. 1), wurden aus Messungen an 30 Kristallen ermittelt.

Wir ermitteln die Schrittgeschwindigkeit v, indem wir die Verschiebungen von 8–13 einzelnen Schritten überwachen. Für jeden einzelnen Schritt wurden ca. 25–35 Messungen durchgeführt, insgesamt ca. 300 Messungen. Die durchschnittlichen Schrittgeschwindigkeiten wurden durch Analyse aufeinanderfolgender Bilder über die Zeit ermittelt.

Um die Geschwindigkeit der zweidimensionalen Keimbildung neuer Schichten (J2D) zu bestimmen, wurde das Auftreten neuer Inseln auf der Oberfläche zwischen aufeinanderfolgenden Bildern überwacht und die Anzahl der gewachsenen Inseln gezählt. Diese Zahl wurde mit dem Scanbereich und dem Zeitintervall zwischen den Bildern skaliert, um J2D aus dem Durchschnitt von 15–25 Messungen zu ermitteln.

In-vitro-P.-falciparum-Experimente zum Testen der Reversibilität der Hemmung (Abb. 5) wurden in biologischen Duplikaten zu verschiedenen Zeitpunkten mit technischen Dreifachvertiefungen mit notierten Arzneimittelverdünnungen durchgeführt. Das Prism-Softwarepaket wurde verwendet, um Dosis-Wirkungs-Verhältnisse gegenüber Hemmung mit nichtlinearer Anpassung zu generieren.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Es wurde kein maßgeschneiderter Computercode verwendet. Quelldaten für die Abbildungen finden Sie unter „Supplementary Data“.

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Diese Arbeit wurde von NIH (Auszeichnung Nr. R01 AI150763), NSF (Auszeichnung Nr. DMR 2128121) und der Welch Foundation (Zuschüsse Nr. E-2170 und E-1794) unterstützt. DJS dankt dem Johns Hopkins Malaria Research Institute und der Bloomberg Family Foundation für seine Unterstützung.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Wenchuan Ma, Victoria A. Balta.

William A. Brookshire Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Houston, Houston, TX, 77204, USA

Wenchuan Ma, Weichun Pan, Jeffrey D. Rimer und Peter G. Vekilov

W. Harry Feinstone Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Immunologie, Malaria Research Institute, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, Baltimore, MD, 21205, USA

Victoria A. Balta und David J. Sullivan

Abteilung für Angewandte Chemie, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou, Zhejiang, 314423, China

Weichun Pan

Fakultät für Chemie, University of Houston, Houston, TX, 77204, USA

Jeffrey D. Rimer und Peter G. Vekilov

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WM und VAB trugen gleichermaßen bei. DJS und PGV haben dieses Projekt konzipiert. PGV, DJS und JDR haben Experimente entworfen. WM führte alle AFM- und Massenkristallisationsexperimente durch. WP führte eine Lichtstreucharakterisierung durch. VAB führte alle Malariaparasitentests durch. WM, VAB, JDR, DJS und PGV haben den Text geschrieben.

Korrespondenz mit Jeffrey D. Rimer, David J. Sullivan oder Peter G. Vekilov.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Angel Romero, Diogo Moreira und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ma, W., Balta, VA, Pan, W. et al. Nichtklassische Mechanismen zur irreversiblen Unterdrückung des Kristallwachstums von β-Hämatin. Commun Biol 6, 783 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05046-z

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Eingegangen: 05. Oktober 2022

Angenommen: 14. Juni 2023

Veröffentlicht: 27. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05046-z

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