Elektromagnetische Deaktivierungsspektroskopie des menschlichen Coronavirus 229E

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8886 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine Untersuchung der Deaktivierung von Krankheitserregern mittels elektromagnetischer Wellen im Mikrowellenbereich des Spektrums gelingt mithilfe speziell angefertigter Wellenleiterstrukturen. Die Wellenleiter verfügen über Subwellenlängengitter, um die Integration eines Luftkühlsystems zu ermöglichen, ohne die internen Ausbreitungsfelder zu stören. Die Wellenleiter sind verjüngt, um eine Versuchsprobe im Inneren unterzubringen und einen ausreichenden umgebenden Luftstrom zu gewährleisten. Die vorgeschlagene Methodik ermöglicht eine präzise Kontrolle der Leistungsdichten aufgrund der genau definierten Grundmode, die in jedem Wellenleiter angeregt wird, zusätzlich zur Temperaturkontrolle der Probe aufgrund der Mikrowellenexposition im Laufe der Zeit. Das menschliche Coronavirus (HCoV-229E) wird im Bereich von 0–40 GHz untersucht, wobei im Teilband 15,0–19,5 GHz eine maximale Virusreduktion von 3 Log beobachtet wird. Wir kommen zu dem Schluss, dass HCoV-229E in diesem Bereich eine intrinsische Resonanz aufweist, in der die nichtthermische Strukturschädigung durch den strukturresonanten Energieübertragungseffekt optimal ist.

Die Deaktivierung von Krankheitserregern mithilfe elektromagnetischer (EM) Wellen im Mikrowellenband stößt auf wachsendes Forschungsinteresse1,2,3,4,5,6,7,8,9. Der kontaktlose Charakter der Mikrowellen-Deaktivierung ist ein Merkmal, das die Methode im Kontext der durch die jüngste und anhaltende SARS-CoV-2-Pandemie verursachten Krisen im Bereich der öffentlichen Gesundheit besonders nützlich macht. Mikrowellen können ein Virion auf zwei Arten deaktivieren: durch thermische Erwärmung oder durch einen Prozess, der als strukturresonanter Energietransfer (SRET) bekannt ist. Letzteres basiert auf der Idee, dass umhüllte Viren mit einfachen Kugelgeometrien in Gegenwart einer EM-Welle mitschwingen2,3,4,5. Die Maximierung der Amplitude der akustischen Schwingungen, die in einem kugelförmigen Virus angeregt werden, ist wichtig, um die größtmögliche Verschiebung und Belastung der Hüllenstruktur zu bewirken, die schließlich zum Bruch führen kann. Aktuelle Modellierungen akustischer Dipolar-Mode-Schwingungen in kugelförmigen Viren sagen voraus, dass die größte Belastung durch EM-Wellen gleicher Intensität im Mikrowellenbereich auftritt2,4,10, was durch eine wachsende Zahl experimenteller Beweise gestützt wird2,3,5. Die Deaktivierung des Influenza-A-Virus (H3N2) wurde mithilfe von Mikrowellen geringer Leistungsdichte nachgewiesen, bei denen die Virusmembran durch den SRET-Effekt aufgebrochen wird2. In dieser Studie kam es bei einer Virenlösung nach 15 Minuten Mikrowellenbeleuchtung durch eine bei 8,2 GHz betriebene Hornantenne zu einer Reduzierung des aktiven Virus um 3 Logarithmen. Die Anwendung des SRET-Effekts ist aufgrund der vorgeschlagenen geringen erforderlichen Leistungsdichten ein vielversprechendes nichtthermisches Mittel zur Deaktivierung schädlicher Krankheitserreger mit intrinsischen Resonanzen im Mikrowellenbereich2,3,4.

Die Mikrowellensterilisation mit geringer Leistung und ohne Erhitzung erfordert die Kenntnis der intrinsischen natürlichen Resonanz des Virions, um möglichst viel der begrenzten verfügbaren Energie möglichst effizient zu übertragen. Die experimentelle Untersuchung der Mikrowellenabsorptionsspektroskopie eines Virus ist technisch anspruchsvoll, insbesondere aufgrund der erforderlichen Empfindlichkeit, um eine den kleinen Partikeln zugeschriebene Reaktion vernünftig zu erkennen und zu unterscheiden. Zu den vorgeschlagenen Methoden gehörten Mikrowellenübertragungsleitungen, in die kleine Lösungsmengen eingeführt wurden, um die geführten Mikrowellen innerhalb der Struktur zu stören2,3,5,8. Der Sensor wird zunächst nur mit der Trägerflüssigkeit als Referenz gemessen, gefolgt von einer Messung, die eine gewisse Viruskonzentration enthält. Anschließend wird ein relativer Vergleich durchgeführt, um Bereiche zu identifizieren, in denen mehr Mikrowellenleistung verloren geht, was auf eine Absorption durch das Virus hinweist. Diese Methode wurde verwendet, um Mikrowellenabsorptionsresonanzen von SARS-CoV-23, Influenza A (H3N2)2 und dem White-Spot-Syndrom-Virus8 zu identifizieren.

In diesem Bericht stellen wir eine neuartige temperaturkontrollierte Methode zur Untersuchung elektromagnetischer Wechselwirkungen mit Krankheitserregern vor. Das menschliche Coronavirus HCoV-229E (229E) wird als Ersatzmodell für die biologische Sicherheit für höher pathogene Coronaviren ausgewählt. Seine kugelförmige Geometrie und die Anordnung der Spike-Proteine sind repräsentativ für viele umhüllte Viren. Unsere Methodik wird durch die Untersuchung der SRET-basierten Deaktivierung von 229E im Bereich von 0,8–40 GHz und die Identifizierung einer intrinsischen Resonanz im Bereich von 15,0–19,5 GHz demonstriert. Innerhalb dieses Regimes wurde eine 3-log-Reduktion des aktiven Virus nach nur 7,5 Minuten Mikrowellen-Exposition beobachtet. Es werden rechteckige Wellenleiter verwendet, die eine Probe im Inneren aufnehmen und die Probe wohldefinierten elektrischen Feldern aussetzen sollen. Dies bietet den entscheidenden Vorteil einer präzisen Kontrolle über die Feldstärke und Leistungsdichte, die der Versuchsprobe ausgesetzt sind. In die Wellenleiterwände werden Subwellenlängengitter eingebracht, um ein Luftstromkühlsystem zu integrieren, ohne die sich ausbreitenden Felder zu stören. Während der Experimente werden Virusproben kontinuierlich gekühlt, um sicherzustellen, dass jede beobachtete Deaktivierung auf die durch SRET induzierten akustischen Schwingungen zurückzuführen ist und nicht auf eine übermäßige Mikrowellenerwärmung der Trägerlösung. Mit dieser Methodik können Viren unter verschiedenen Leistungsdichte- und Zeitkriterien untersucht werden, sodass optimale Frequenzregime und der erwartete Grad der Virusdeaktivierung bestimmt werden können. Diese Informationen sind von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung neuer mikrowellenbasierter Technologien zur Übertragungskontrolle, Sterilisation und klinischen Behandlungen.

Um die Virusproben gleichmäßig zu bestrahlen und gleichzeitig die Temperatur zu kontrollieren, wurde eine Reihe von Wellenleitern entwickelt, die die Hochfrequenzleistung (RF) auf die Probe richten und außerdem ermöglichen, dass Luft an der Probe vorbeiströmt, um die Temperatur aufrechtzuerhalten. Diese Wellenleiter wurden entwickelt, um Proben über eine möglichst große Bandbreite abzustrahlen und dabei im Grundmodus zu arbeiten, wobei nach Möglichkeit kommerzielle Wellenleiter-Trägerraketen verwendet werden. Dies erforderte die Verwendung vieler Wellenleiterbänder, um einen großen Spektrumbereich abzudecken, wie in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 zeigt die Abmessungen des Speisewellenleiters (a und b) sowie die Abmessungen des Wellenleiters, an dem sich die Röhre befand ( \(a_{tube}\) und \(b_{tube}\)). Ein Beispiel für diese Abmessungen ist in Abb. 1 dargestellt. Dieses Bild wurde aus dem CAD-Modell (Computer Aided Design) erstellt, das zum Entwurf der Wellenleiter verwendet wurde. Alle mechanischen CAD-Arbeiten wurden in Dassault Systems Solidworks 2021 abgeschlossen.

In allen Fällen wurden Koaxial-Wellenleiter-Launcher verwendet, außer im unteren Band (0,8–1,8 GHz), wo eine Wellenleitersonde für eine Leiterplatte (PCB) in einen Wellenleiter mit reduzierter Höhe eingespeist wurde. Alle Reagenzgläser waren mit 600 μl Flüssigkeit gefüllt und befanden sich in der Mitte des Wellenleiters, wobei die Flüssigkeit in der Mitte des Wellenleiterquerschnitts positioniert war, um die Exposition der Probe gegenüber der Flüssigkeit zu maximieren elektromagnetisches Feld. Bei höheren Frequenzen erforderte dies eine Erweiterung von \(a_{tube}\) und \(b_{tube}\) relativ zu a und b, damit die Virusprobe vollständig in den Wellenleiter passt und Platz zwischen dem Reagenzglas und den Wänden des Reagenzglases bleibt Wellenleiter zur Kühlung.

(a) Draufsicht und (b) Seitenansicht eines Wellenleitersensors mit Darstellung der Abmessungen der Zuführung (a und b) und der Abmessungen des Wellenleiters um das Reagenzglas. Bild generiert aus dem CAD-Modell der in Dassault Systemes Solidworks (Version 2021) entworfenen Wellenleiter.

Die Reagenzglasproben werden gekühlt, indem Luft durch den Wellenleiter und am Probenröhrchen vorbeigedrückt wird. Dies wurde mithilfe von Gebläsen erreicht, wie in Abb. 2 dargestellt, die Luft durch Gitter an der Seite des Wellenleiters an der Probe vorbei drückten und durch einen Abluftkanal austraten. Diese Gitter waren metallisiert und so konstruiert, dass sie Löcher hatten, die groß genug waren, um Luft durchzulassen, aber dennoch klein genug im Verhältnis zur Signalwellenlänge, um den Großteil der HF-Energie im Wellenleiter aufzunehmen.

Allgemeine Montage des Wellenleitersensors. Bild generiert aus dem CAD-Modell der in Dassault Systemes Solidworks (Version 2021) entworfenen Wellenleiter. Modelle für die WR90-Trägerraketen wurden ab 11 kostenlos zur Verfügung gestellt.

Die Wellenleiter wurden mittels Fused Deposition Modeling (FDM) aus Polymilchsäure (PLA) 3D-gedruckt und mit Aluminiumband metallisiert. Diese Technik eignet sich für das schnelle Prototyping von Wellenleiterteilen mit einer Leistung, die mit der von Ganzmetallkomponenten vergleichbar ist 12,13. Diese Methode wurde verwendet, um jedes der in Tabelle 1 gezeigten Wellenleiterbänder mit Ausnahme des untersten Bandes zusammenzubauen. Unterhalb von 1,8 GHz wurde der Wellenleiter durch Falten von Blechen zur Bildung der Wände implementiert und ein Gerüstrahmen wurde in 3D gedruckt, um die Metallbleche zusammenzuhalten. Wie bereits erwähnt, wurde dieser Wellenleiter mithilfe einer PCB-Sonde gespeist. Beispielbilder der zusammengebauten Wellenleiter sind in Abb. 3 dargestellt. Die Wellenleiterstrukturen wurden mit einem Vollwellen-Finite-Elemente-Löser (ANSYS HFSS) simuliert, um die Feldintensitäten in der Mitte des Virusprobenröhrchens zu bestimmen. Die Eingangsleistung wurde auf 2 Watt eingestellt und Simulationen wurden für den Fall eines leeren, mit Luft gefüllten Röhrchens und für den Fall eines mit dem dielektrischen Modell für die Virusträgerlösung gefüllten Röhrchens durchgeführt. Die simulierten Feldstärken sind in Abb. 4 dargestellt. Die Feldstärken für das mit Flüssigkeit gefüllte Reagenzglas im Vergleich zum mit Luft gefüllten Reagenzglas (insbesondere bei höheren Frequenzen) sind auf das zunehmende \(\epsilon _r\) der Trägerlösung zurückzuführen mit der Frequenz im Vergleich zu Luft.

Bilder von zusammengebauten Wellenleiterkomponenten und Leistungsverstärkern, die zur Durchführung der Virusdeaktivierungsexperimente verwendet wurden. Jeder der Wellenleiter wurde von der Gruppe entworfen und gedruckt, und der Verstärker wurde von der Gruppe aus handelsüblichen Komponenten zusammengebaut.

Simulierte Feldintensitäten in der Mitte des Reagenzglases, wenn das Reagenzglas mit (a) Luft oder (b) Medien mit reduziertem Serumgehalt gefüllt war.

Die komplexe Permittivität liefert eine vollständige zeitharmonische EM-Beschreibung eines Mediums. Die komplexe Permittivität des serumreduzierten Mediums (OptiMEM) ohne Virus wird mithilfe der Methode der offenen Koaxialsonde charakterisiert. Ein frequenzabhängiges Modell wird mithilfe einer zuvor entwickelten Methodik14 erstellt und ist in Abb. 5 zusammen mit entionisiertem (DI) Wasser als Referenz dargestellt. Die hohe Dielektrizitätskonstante des Mediums mit reduziertem Serumgehalt kann erhebliche Reflexionen innerhalb des luftgefüllten Wellenleiters verursachen, und wenn dies nicht im Design unberücksichtigt bleibt, könnte die Eingangsanpassung experimenteller Wellenleiter erheblich beeinträchtigt werden. Aus diesem Grund ist das Permittivitätsmodell in die EM-Simulationswerkzeuge integriert, um beim Entwurf, der Abstimmung und der Bewertung von Wellenleiterstrukturen zu helfen, sodass in den experimentellen Fällen, die Proben enthalten, eine hohe HF-Leistung erreicht wird. Da die Viruskonzentration in den Proben niedrig ist, wurde davon ausgegangen, dass die dielektrischen Eigenschaften der Medien mit reduziertem Serumgehalt unabhängig vom Vorhandensein des Virus nur minimal beeinträchtigt würden.

Dielektrisches Modell eines Mediums mit reduziertem Serumgehalt im Vergleich zu entionisiertem (DI) Wasser.

Von Versuchsproben absorbierte Mikrowellenenergie führt sowohl zu einer Erwärmung als auch zu Störungen der Virusstruktur. Ohne ein Kühlsystem zur Abfuhr überschüssiger Wärme könnte die Virustemperatur ausreichende Kriterien erreichen, so dass eine hitzebedingte Reduzierung beobachtet werden würde. Die Erwärmung des Mediums mit reduziertem Serumgehalt aufgrund der Mikrowellenexposition während experimenteller Verfahren wird charakterisiert, um zu überprüfen, ob das integrierte Kühlsystem in der Lage ist, überschüssige Wärme ausreichend abzuleiten und sicherzustellen, dass eine beobachtete Virusdeaktivierung nicht auf Hitze zurückzuführen ist. Insbesondere darf die Virustemperatur in allen Experimenten 44 °C nicht überschreiten, da ein gewisses Maß an hitzebedingter Deaktivierung von HCoV-229E zu erwarten wäre. Es ist bekannt, dass andere Coronaviren eine Inaktivierung zeigen, wenn sie im Bereich von 44 °C bis 65 °C in vergleichbar kurzen Zeiträumen (< 15 Minuten) wie den in dieser Arbeit verwendeten erhitzt werden15. Über das in dieser Studie untersuchte Spektrum wird eine gewisse Variation der experimentellen Probenerwärmung beobachtet. Auch wenn die Eingangsleistung in allen experimentellen Fällen konstant ist, verändert die Variation der Wellenleiterabmessungen die Leistungsdichte der geführten Wellen und verändert auch den Raum um die Probe herum, damit die Luft strömen kann. Darüber hinaus variieren die dielektrischen Eigenschaften des Mediums mit reduziertem Serumgehalt mit der Frequenz, nämlich dem Verlustfaktor, der den Anteil der vom Medium absorbierten Leistung beeinflusst. Aus diesen Gründen muss die Charakterisierung der Probenerwärmung in jedem Fall einzeln durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Probe ausreichend gekühlt ist. Der Temperaturanstieg im Vergleich zur nominalen Raumtemperatur (25 \(^\circ\)C) während der Deaktivierungsexperimente ist in Tabelle 2 zusammengefasst. In allen Fällen bleibt die Erwärmung der angesammelten Probe unter 15 \(^\circ\)C, was gewährleistet Keine experimentelle Probe würde in allen Fällen 40 \(^\circ\)C überschreiten.

Die Deaktivierung von HCoV-229E wird in Teilbereichen des gesamten Frequenzspektrums bis 40 GHz untersucht. Für jede Teilbande werden mehrere Proben mit gleicher Konzentration an HCoV-229E vorbereitet, sodass die Experimente mehrmals wiederholt werden können, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu erhöhen. Die Proben werden in Versuchs- und Kontrollgruppen eingeteilt, wobei nur Versuchsproben in die Wellenleiterstruktur eingeführt und einem Frequenzbereich ausgesetzt werden. Die Einzelheiten des experimentellen Sweep-Plans für jedes Teilband finden Sie im Abschnitt zur Methodik. Mithilfe der Plaque-Assay-Analyse wird die aktive Viruskonzentration nach der Mikrowellen-Exposition bestimmt und mit der Kontrollprobe verglichen, um die relative Virusreduktion festzustellen. Für alle Banden ist die durchschnittliche Virusreduktion über alle Versuche in Abb. 6 dargestellt, wobei jeweils ein Fehlerbalken die Standardabweichung des Versuchssatzes darstellt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Wenn die durchschnittliche Reduktion im Vergleich zur Kontrolle weniger als das Zehnfache beträgt oder die Versuchs- und Kontrollsätze überlappende Standardabweichungsintervalle aufweisen, wird in der Spalte „Virusreduktion“ in Tabelle 2 „unbedeutend“ angegeben dieses Experiment. Für alle Banden ist die beobachtete Virusreduktion in Abb. 6 dargestellt und in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Virusreduktion muss sowohl statistisch signifikant als auch größer als das Zehnfache sein, andernfalls wird für die jeweilige Bande „unsignifikant“ angegeben.

Virusinaktivierung als Reaktion auf Mikrowellen-Exposition.

Die primären Ergebnisse dieser Studie zeigen eine intrinsische Resonanz von HCoV-229E im Frequenzbereich von 15,0–19,5 GHz. Nach 7,5 Minuten Mikrowellen-Exposition wird eine 3-log-Reduktion der aktiven Viruskonzentration innerhalb dieser Bande beobachtet. Dieser Grad der Virusdeaktivierung ist mit dem in anderen SRET-Studien beobachteten vergleichbar, wird jedoch über einen kürzeren Zeitraum erreicht. Darüber hinaus wurde im angrenzenden Band von 12,4–15,0 GHz eine Reduzierung um 1 Log beobachtet, was auf eine gewisse Empfindlichkeit hinweist, in der Nähe der Resonanz jedoch nicht so optimal und effizient ist. Außerhalb des Bereichs 12,4–19,5 GHz wurde keine wesentliche und statistisch signifikante Verringerung beobachtet. Die stärkste Probenerwärmung trat im Bereich von 8,2–12,4 GHz auf und erreichte während der Experimente 40 °C, obwohl keine signifikante Verringerung beobachtet wurde. Dieses Ergebnis unterstützt weiter, dass die beobachtete Virusreduktion in anderen Banden auf Strukturschäden aufgrund des SRET-Effekts und nicht auf Erhitzung zurückzuführen ist.

Für die virale Deaktivierungsspektroskopie sind rechteckige Wellenleiter im Vergleich zu anderen geführten (Mikrostreifenleitungen, koplanarer Wellenleiter) und strahlenden (Antenne) Lösungen vorteilhaft. Erstens haben die Felder in rechteckigen Wellenleitern genau definierte Ausbreitungsmodi. Dies ermöglicht eine genauere Bestimmung der elektrischen Felder und der Leistungsdichte innerhalb des Wellenleiters, selbst in Anwesenheit einer experimentellen Probe. Dies ist besonders nützlich in Fällen, in denen die Deaktivierungsreaktion eines Krankheitserregers auf verschiedene Feldintensitäten oder Leistungsdichten untersucht werden soll. Darüber hinaus können rechteckige Wellenleiter verjüngt werden, um zusätzlichen Platz für die bequeme Integration einer experimentellen Probe zu schaffen, wie es in dieser Arbeit durchgeführt wurde. Dadurch wird der Querschnitt des Leiters, in dem sich die Probe befindet, verändert, nicht aber die Ausbreitungsmoden, sodass Leistungsdichten und elektrische Feldstärken weiterhin präzise bestimmt werden können. Übertragungsleitungen auf Leiterplatten, wie zum Beispiel Mikrostreifenleitungen oder koplanare Wellenleiter, sind im Hinblick auf den verfügbaren Platz und die einfache Integration einer experimentellen Probe eingeschränkter. In diesen Fällen können Versuchsproben praktisch nur oberhalb des signalseitigen Leiters platziert werden. Dies ist jedoch im Hinblick auf die Feldexposition der Probe äußerst ineffizient, da die Felder hauptsächlich im Substrat zwischen dem Signalleiter auf der Oberseite und dem Erdungsleiter auf der Rückseite enthalten sind. Systeme, die eine Virusprobe mithilfe von Antennen ausstrahlen, lassen sich genauso einfach in die Probe integrieren wie rechteckige Wellenleiter, eignen sich jedoch nicht gut für Einstellungen mit hoher Leistung. Während die Antennenhardware hohe Leistungen verarbeiten kann, sind für die Abstrahlung auf diesen Ebenen zusätzliche absorbierende Materialien und HF-Abschirmungen erforderlich, um sicher ausgeführt zu werden, und sie unterliegen zusätzlichen Vorschriften und Beschränkungen16,17. Umgekehrt können rechteckige Wellenleiter hohe Leistungspegel verarbeiten und selbständig halten, wodurch das Risiko einer HF-Exposition für das an der Durchführung der Experimente beteiligte Personal minimiert wird.

Die Entwicklung mikrowellenbasierter Sterilisationssysteme, klinischer Behandlungen und anderer Übertragungskontrolltechnologien beruht im Wesentlichen auf der Kenntnis der zu verwendenden Frequenzen und des zu erwartenden Ausmaßes der aktiven Virusreduktion über einen bestimmten Zeitraum. Die in diesem Artikel beschriebene Methode der Virusdeaktivierungsspektroskopie liefert nachweislich diese Informationen für HCoV-229E und ist auch auf die Untersuchung anderer elektromagnetischer Wechselwirkungen mit Krankheitserregern im Mikrowellenbereich anwendbar. Darüber hinaus kann die vorgeschlagene Methodik verwendet werden, um die Auswirkungen der einfallenden Leistungsniveaus sowie der Expositionsdauer in Bezug auf die Reduzierung des SRET-Virus zu untersuchen, von denen bekannt ist, dass sie einen Einfluss haben2. Im Allgemeinen verursacht die Einwirkung von Mikrowellen auf eine Virusprobe zusätzlich eine gewisse Erwärmung zu induzierten akustischen Schwingungen innerhalb der Virionen. Die integrierte Temperaturkontrolle der experimentellen Wellenleiter gibt jedoch die Gewissheit, dass die beobachtete Virusreduktion auf strukturelle Schäden durch akustische Vibrationen und nicht auf übermäßige Erwärmung zurückzuführen ist. Im Hinblick auf die Kontrolle der Übertragung von Krankheitserregern kann Erhitzen unerwünscht sein. In Sterilisationsumgebungen können sich viele Materialien zersetzen oder beschädigt werden, wenn sie über einen längeren Zeitraum oder auf relativ hohe Temperaturen erhitzt werden. Mikrowellentechnologien mit geringer Leistung sind für diese Umgebungen vielversprechend, da eine erhebliche aktive Virusreduktion bei gleichzeitiger Beibehaltung sicherer Erwärmungsniveaus möglich ist.

In diesem Bericht wird eine neuartige Methode zur Untersuchung der funktionellen Virusinaktivierung als Reaktion auf elektromagnetische Felder vorgestellt. Die vorgeschlagene Methodik wurde durch die Untersuchung von 229E im Mikrowellenspektrum und die Identifizierung von Regimen mit einer deutlichen und signifikanten Reduzierung der viralen Infektiosität demonstriert. Wie in unserem Abschnitt „Diskussion“ beschrieben, können diese Informationen zur Entwicklung und Optimierung von Übertragungskontrolltechnologien verwendet werden, die auf ähnliche kugelförmige Viren abzielen. Weitere Studien, die über den Rahmen dieser Arbeit hinausgehen, wären erforderlich, um die genauen Mechanismen der Virusstrukturschädigung als Reaktion auf elektromagnetische Felder zu bestätigen.

Der luftgekühlte Wellenleiter wurde für den 3D-Druck aus PLA entwickelt und mit Aluminiumfolienband metallisiert. Diese Entwurfsmethodik wurde bereits in 12,13,18 bewährt und ermöglicht ein schnelles Prototyping von Wellenleiterkomponenten. Jeder Wellenleiter wurde in vier Abschnitten gedruckt, wodurch das Aluminiumband auf einer ebenen Oberfläche angebracht werden konnte, um Faltenbildung zu reduzieren. Die Abschnitte des Hohlleiters wurden geschlitzt und miteinander verschraubt. Die Wellenleiter wurden jeweils von handelsüblichen Wellenleiterwerfern gespeist und waren konisch, um der Größe des Virusprobenröhrchens gerecht zu werden. Um die Proben zu kühlen, wurden Löcher in die Seiten des Wellenleiters geschnitten und mit einem Gitter gefüllt. Dieses Gitter ließ Luft durch den Wellenleiter strömen, hielt aber die HF-Leistung im Inneren des Leiters zurück. Für jeden Wellenleiter wurden diese als separates Stück gedruckt und auf der Wellenleiterseite mit Aluminiumband und auf der Außenseite mit einer leitfähigen Farbe auf Kupferbasis (MG-Chemicals 843WB) metallisiert, um die Isolierung zu erhöhen. Jeder Wellenleiter hatte vier dieser Gitter; zwei hatten Axialventilatoren, um Luft in den Wellenleiter zu drücken, und die anderen beiden fungierten als Austrittsöffnungen mit Kanälen, um die warme Luft vom Ventilatoreinlass wegzuleiten. Schließlich enthielt jeder Wellenleiter einen Platz für das Probenröhrchen. Dabei handelte es sich um ein Loch in der Seite des Wellenleiters, das genau auf das Reagenzglas passte, metallisiert war und über eine metallisierte Abschirmkappe verfügte, die zusammen die HF-Energie im Wellenleiter enthielt.

Ein Signalgenerator (Anritsu MG3694A) wird verwendet, um Mikrowellentöne bei gewünschten Frequenzen zu erzeugen. Leistungsverstärkungsstufen werden verwendet, um die Leistung der Signalgeneratortöne so zu erhöhen, dass 2 W Leistung an den experimentellen Wellenleitereingang geliefert werden. Um das große untersuchte Spektrum abzudecken, waren mehrere Konfigurationen für Energieanwendungen erforderlich. Im Bereich von 0,8–8,2 GHz werden fünf Paketverstärker (Analog Devices HMC659LC5) verwendet: einer in Reihe und vier parallel, deren Leistung kombiniert wird, um den Zielleistungspegel zu erreichen. In den Bereichen 8,2–19,5 GHz und 20–40 GHz wird ein einzelner Verstärker (Mini-Circuits ZVE-3W-183+ bzw. Qorvo QPA2640D) zur Leistungsverstärkung verwendet. Das Leistungsverhalten aller Verstärkungsstufen wird durch Wobbeln der einfallenden Leistung vom Signalgenerator und Messen der Ausgangsleistung auf einem Spektrumanalysator (Anritsu E4446A) charakterisiert. Dieser Vorgang wird bei jeder im experimentellen Virendeaktivierungs-Sweep-Plan verwendeten Frequenz wiederholt. Anschließend werden die Leistungsverstärkungscharakterisierungsdaten im Speicher eines eingebetteten Systems mit digitaler Unterstützung gespeichert, das mit dem Signalgenerator verbunden ist. Dieses System korrigiert intrinsische Frequenzschwankungen innerhalb jeder Leistungsverstärkungsstufe, indem es die Leistung des einfallenden Signalgenerators so anpasst, dass die Ausgangsleistung bei allen Frequenzen genau 2 W (33 dBm) beträgt.

Das untersuchte 0,8–40-GHz-Spektrum wird basierend auf dem unterstützten Frequenzbereich jeder verwendeten Wellenleiterbezeichnung in 10 Unterbänder diskretisiert, die in Tabelle 2 zusammengefasst sind. Der experimentelle Bereich von 0,8–40 GHz wurde ausgewählt, um die in2 enthaltenen und zu umgebenden Unterbänder zu berücksichtigen. 3, wo Resonanzen für vergleichbare Viren beobachtet wurden. Um dieses Band abzudecken, wurden mehrere Wellenleiter verwendet, sodass jeder Test bei der Grundfrequenz des Wellenleiters durchgeführt werden konnte. Es war entscheidend, in der Grundfrequenz des Wellenleiters zu arbeiten, sodass das Feldmaximum in der Mitte jeder Virusprobe lag. Jedes Unterband verwendet einen identischen Mikrowellen-Sweep-Plan, der aus 10 gleichmäßig verteilten diskreten Tönen innerhalb seines jeweiligen Bandes besteht. Die Mikrowellenerzeugungs- und -verstärkungsstufe erzeugt jeden Ton mit einer Einfallsleistung von 2 W für 45 Sekunden in aufsteigender Reihenfolge auf den Wellenleiter, was einer Gesamtdurchlaufzeit von 7,5 Minuten entspricht. Die gesamte Sweep-Zeit wurde so gewählt, dass sie mit der in2 vergleichbar ist, bei der eine signifikante Virusreduktion beobachtet wurde. Lebendvirusproben mit gleicher Konzentration werden vorbereitet und in Versuchs- und Kontrollgruppen aufgeteilt. Beide Gruppen, Kontroll- und Versuchsgruppe, enthalten jeweils drei Proben, sodass jedes Experiment (Unterband) dreimal wiederholt werden kann, um die Wiederholbarkeit und die durchschnittliche Virusreduktion zu analysieren. Alle Proben werden für die Dauer der Experimente in einem Eisbad gelagert. Experimentelle Proben werden vorübergehend aus dem Eisbad entfernt und in den Wellenleiter eingeführt, die anschließend gemäß dem beschriebenen Sweep-Plan sich ausbreitenden Mikrowellenfeldern ausgesetzt werden. Kontrollproben werden keiner Mikrowellen ausgesetzt. Für jedes Teilband wird das Experiment drei Versuche lang wiederholt. Die Plaque-Assay-Analyse wird verwendet, um die durchschnittliche Reduktion des aktiven Virus in experimentellen Proben im Vergleich zu den Kontrollproben zu bestimmen.

Die Erwärmung des Mediums mit reduziertem Serum (OptiMEM) wird charakterisiert, um das Ausmaß der Viruserwärmung während Virusdeaktivierungsexperimenten zu bestimmen. Es wird eine Probe vorbereitet, die das gleiche Volumen an Medium enthält, das in experimentellen Versuchen verwendet wird. Zunächst wird die Temperatur der Probe gemessen, um die Raumtemperatur zu bestimmen. Anschließend wird die Probe in den Versuchsaufbau eingesetzt, wo der Virendeaktivierungs-Sweep-Plan ausgeführt wird und die Probe innerhalb der Wellenleiter Mikrowellen ausgesetzt wird. Nach Abschluss des Sweep-Plans wird die Probentemperatur sofort gemessen, um etwaige Erwärmungen aufgrund der Mikrowelleneinwirkung zu charakterisieren. Dieses Verfahren wird für jedes in diese Studie einbezogene Teilband wiederholt, um zu überprüfen, dass die Probenerwärmung ausreichend gering ist und nicht in allen Fällen zur Virusdeaktivierung beiträgt.

Die Methode der offenen Koaxialsonde wird zur Messung der komplexen Permittivität des Mediums mit reduziertem Serumgehalt verwendet. Zur Messung der Reflexionen an den Sondenspitzen wird ein Vektornetzwerkanalysator (Anritsu MS4644B) verwendet. Dielektrische Sonden werden mithilfe von Standardmessungen in offenem, kurzem und entionisiertem Wasser kalibriert. Das Medium mit reduziertem Serumgehalt wird in ein sauberes Becherglas mit 50 mm Durchmesser überführt, um eine ausreichend große und gleichmäßige Probe der Flüssigkeit herzustellen. Die Sondenspitzen werden 10 mm tief in das Medium eingetaucht und mit dem Vektornetzwerkanalysator gemessen. Mithilfe der Kalibrierungsmessungen werden dann komplexe Permittivitätsinformationen (Dielektrizitätskonstante, Verlustfaktor) über die Frequenz berechnet. Mithilfe der Permittivitätsmessungen wird mit einer zuvor entwickelten Methodik ein empirisches Modell erstellt14. Dieses Modell berücksichtigt die Frequenzvariation der EM-Eigenschaften des Mediums, was die Simulationsgenauigkeit erheblich verbessert.

HCoV-229E wurde von BEI Resources (NR-52726) bezogen und wie zuvor beschrieben19 vermehrt. HCoV-229E-Bestände wurden durch einen Standard-Plaqueing-Assay auf Huh7-Zellen titriert19. Huh7-Zellen (JCRB0403) wurden von der Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank bezogen. Die Zellen wurden in Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM) mit 10 % FBS, 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin bei 37 °C in 5 % CO2 kultiviert.

HCoV-229E wurde in OptiMEM (ThermoFisher Scientific, 31985062) auf 1 x \(10^6\) Plaque-bildende Einheiten (PFU)/ml verdünnt. Aliquote (1 ml) des verdünnten Virus wurden in 1,5-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss (Fisher Scientific 02-681-372) verteilt und den verschiedenen beschriebenen Mikrowellenbehandlungen unterzogen. Anschließend wurde die virale Infektiosität mittels Plaque-Assay bewertet. Huh7-Zellen, die am Vortag in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 3,5 x \(10^5\) Zellen/Well ausplattiert wurden, wurden 2 Stunden lang bei 37 \(^\circ\)C mit seriell verdünnten HCoV-229E-Proben infiziert. Nach dem Entfernen des Inokulums wurden die Zellmonoschichten mit 1,2 % Carboxymethylcellulose in DMEM mit 2 % FBS überschichtet und bei 33 °C in 5 % CO2 bis 4 Tage nach der Infektion inkubiert. Die Zellen wurden fixiert und mit einer Kristallviolett-Färbelösung (1 % Kristallviolett in 17 % Methanol in H2O) gefärbt, um die Visualisierung von Plaques zu ermöglichen. Zur Bestimmung des Virustiters wurden die Plaques gezählt.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wird von der kanadischen Regierung, dem Department of National Defence, Innovation for Defense Excellence and Security (IDEaS) unterstützt.

Virusexperimente wurden durch Mittel des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (CCC) und einen Research Initiation Grant der Fakultät für Gesundheitswissenschaften der Queen's University (CCC) unterstützt.

Elektrotechnik und Informationstechnik, Queen's University, Kingston, K7L 3N6, Kanada

Hayden Banting, Ian Goode und Carlos E. Saavedra

Biomedizinische und molekulare Wissenschaften, Queen's University, Kingston, K7L 3N6, Kanada

Carla E. Gallardo Flores und Che C. Colpitts

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Die Autoren IG, HB und CS haben die Experimente konzipiert. Die Autoren IG und HB entwickelten die experimentelle Hardware und Systeme und führten die Experimente durch. Die Autoren CEF und CCC führten einen Plaque-Assay durch und analysierten alle experimentellen Ergebnisse. Alle Autoren haben zum Manuskript beigetragen und es überprüft.

Korrespondenz mit Hayden Banting.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Banting, H., Goode, I., Flores, CEG et al. Elektromagnetische Deaktivierungsspektroskopie des menschlichen Coronavirus 229E. Sci Rep 13, 8886 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36030-6

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Eingegangen: 09. März 2023

Angenommen: 27. Mai 2023

Veröffentlicht: 01. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36030-6

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Elektromagnetische Deaktivierungsspektroskopie des menschlichen Coronavirus 229E